Ανίχνευση μεταλλάξεων στις 5-NTR και VP1 γενωμικές περιοχές εμβολιακών στελεχών πολιοϊών

Abstract

Οι πολιοϊοί ανήκουν στο γένος των εντεροϊών της οικογένειας Picornaviridae. Το γένωμα τους είναι μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας και αντιγράφονται με την ιική RNA- εξαρτοόμενη RNA πολυμεράση. Οι πολιοϊοί διακρίνονται σε τρεις οροτύπους (PV1, PV2, PV3) και είναι οι αιτιολογικοί παράγοντες της παραλυτικής πολιομυελίτιδας. Από το 1960 χρησιμοποιούνται δύο εμβόλια για την εξάλειψη της ασθένειας, αρχικά το IPV (inactivated polio vaccine) και κατόπιν το πιο αποτελεσματικό OPV (oral polio vaccine). Ωστόσο, το OPV εμφάνισε το μειονέκτημα της εμβολιοσυνδεόμενης παραλυτικής πολιομυελίτιδας (VAPP: vaccine-associated paralytic poliomyelitis) μέσω της συσσώρευσης μεταλλάξεων ή και ανσυνδυασμού στο γένωμα των εξασθενημένων εμβολιακών στελεχών Sabin. Πολλές μελέτες έχουν γίνει όσον αφορά τον εντοπισμό μεταλλάξεων ή και ανασυνδυασμού στο γένωμα στελεχών Sabin που απομονώθηκαν από περιπτώσεις VAPP ή από υγιή εμβολιασμένα άτομα προκειμένου να συσχετισθούν με την αύξηση της νευρομολυσματικότητας. Στην συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκαν 13 κλινικά δείγματα Sabin που προέρχονταν από ασθενείς που είχαν εμβολιαστεί με το OPV. Συγκεκριμένα τα δείγματα μελετήθηκαν για τον εντοπισμό μεταλλάξεων στις 5'-NTR και VP1 περιοχές του ιικού γενώματος όπου βρίσκονται οι κύριοι καθοριστές του εξασθενημένου φαινοτύπου των Sabin στελεχών. Προκειμένου να μελετήσουμε αυτές τις δύο γενωμικές περιοχές ακολουθήθηκε η εξής πειραματική διαδικασία: εκχύλιση του ιικού RNA, αντίστροφη μεταγραφή του ιικού RNA και μετατροπή σε cDNA, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με τη χρήση ειδικοόν εκκινητικών μορίων για την ενίσχυση της κάθε περιοχής και αλληλούχιση των προϊόντων της PCR. Στη συνέχεια ακολούθησε επεξεργασία των αλληλουχιών των δειγμάτων με ειδικά προγράμματα βιοπληροφορικής για τον εντοπισμό νουκλεοτιδικών μεταλλάξεων και και τυχόν αμινοξικών αλλαγών. Τέλος, μετά τον εντοπισμό των αμινοξικών αλλαγών, επιτεύχθηκε απεικόνιση των θέσεων των αμινοξικών αλλαγών της VP1 περιοχής, με τη χρήση κατατεθειμένων τρισδιάστατων δομών προτύπων στελεχών ώστε να εντοπιστεί η θέση τους στο ιικό καψίδιο και να μπορεί να προβλεφθεί η επίδρασή τους στην αρμοστικότητα των ιικών στελεχών. Επίσης για τον καθορισμό του γενότυπου των εμβολιακών στελεχών (Sabin 1, Sabin 2 ή Sabin 3) πραγματοποιήθηκε RFLP ανάλυση η οποία βασίζεται στην πέψη του PCR προϊόντος ενός υψηλά συντηρημένου τμήματος της 5'-NTR περιοχής με τρεις περιοριστικές ενδονουκλεάσες (Haelll, Hpall και ΝεοΙ).Από τα 13 συνολικά στελέχη ταυτοποιήθηκαν δέκα στελέχη Sabin τύπου 2 και τρία στελέχη Sabin τύπου 1. Στην VP1 περιοχή το μεγαλύτερο ποσοστό των μεταλλάξεων ήταν συνοδνυμες το οποίο συμφωνεί με το γενικό πρότυπο των μεταλλάξεων των πολιοϊών. Η πλειοψηφία των αμινοξικών αλλαγών (Ile90Met, Lys99Glu, Thrl06Ala, Phe237Ile, Ilel43Thr/Val/Asn) εντοπίζεται στο εξωτερικό του καψιδίου (αντιγονικές θέσεις και θέση πρόσδεσης του ιού στον κυτταρικό υποδοχέα) ενώ μόνο δύο (Val56Ile, Phel36Cys) εντοπίζονται στο εσωτερικό του λόγω της υψηλής αντιγονικής πίεσης που υφίστανται οι πρώτες. Γενικά οι αμινοξικές αλλαγές επηρεάζουν είτε την αλληλεπίδραση ιού-αντισωμάτων (Ile90Met, Lys99Glu) είτε τα αρχικά στάδια του κύκλου ζωής των πολιοϊών (αλληλεπίδραση ιού-υποδοχέα, απελευθέρωση του ιικού RNA στο κύτταρο ξενιστή) (Phe237Ile, Phel36Cys, Val56Ile, Ilel43Thr/Val/Asn). Σχεδόν όλα τα στελέχη εμφανίζουν ποσοστό απόκλισης της VP1 αλληλουχίας τους από την αντίστοιχη αλληλουχία των πρότυπων εμβολιακών στελεχών μικρότερη του 1% και γι αυτό χαρακτηρίζονται ως Sabin-like. Εξαίρεση αποτελεί ένα μόνο στέλεχος στο οποίο το ποσοστό απόκλισης είναι 1,87% και συνεπώς χαρακτηρίζεται ως cVDPV. Στην 5'-NTR περιοχή οι μεταλλάξεις εντοπίζονται τόσο σε μονόκλωνες όσο και σε δίκλωνες περιοχές του IRES cis-acting γενετικού στοιχείου απαραίτητου για την μετάφραση των πολιοϊών. Οι μεταλλάξεις βρίσκονται σε θέσεις που αποτελούν τους κύριους καθοριστές του εξασθενημένου φαινοτύπου των Sabin στελεχών (A481G στα Sabin τύπου 2) είτε σε άλλες θέσεις με μικρότερη επίδραση στον φαινότυπο (T398C, T437C στα Sabin τύπου 2) αλλά όλες δρουν τροποποιώντας την αναδίπλωση του RNA και επηρεάζοντας την αλληλεπίδραση μεταξύ του RNA και παραγόντων του ξενιστή απαραίτητων για την έναρξη της μετάφρασης του ιικού γενοόματος. Για παράδειγμα η μετάλλαξη C583G στα στελέχη Sabin τύπου 1 επηρεάζει την αλληλεπίδραση του κυτταρικού πεπτιδίου ρ52 με την περιοχή VI του IRES γενετικού στοιχείου ενώ η μετάλλαξη T525C επηρεάζει την αλληλεπίδραση του παράγοντα eIF4G με την περιοχή V του IRES γενετικού στοιχείου.