Κλωνοποίηση των γονιδίων που κωδικοποιούν για την αμιδοτρανσφεράση Glu/Asp-AdT από το παθογόνο βακτήριο Helicobacter pylori και το αρχαίο Methanococcus jannaschii σε μορφή οπερονίου

Abstract

Η αντίδραση της αμινοακυλίωσης αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα στάδια κατά την πρωτεϊνοσύνθεση, αφού η αμινοακυλίωση ενός tRNA με το λάθος αμινοξύ μπορεί να επιφέρει την παραγωγή μιας μη λειτουργικής πρωτεΐνης και κατά συνέπεια το θάνατο του κυττάρου. Τα ένζυμα που συμμετέχουν σ' αυτή την αντίδραση καλούνται αμινοάκυλο-tRNA συνθετάσες. Η αντίδραση της αμινοακυλίωσης διαφέρει ανάμεσα στους οργανισμούς και μπορεί να διεξαχθεί μέσω δύο μονοπατιών. Το πρώτο μονοπάτι περιλαμβάνει την άμεση αμινοακυλίωση του tRNA από μία συνθετάση με το κατάλληλο αμινοξύ ενώ το δεύτερο μονοπάτι περιλαμβάνει την έμμεση αμινοακυλίωση του tRNA από μία μη εξειδικευμένη συνθετάση (ND-AARS) και μία αμιδοτρανσφεράση (AdT). Το ένζυμο AdT, που έχει εντοπιστεί στα βακτήρια και στα διάφορα οργανίδια των ευκαρυωτικών κυττάρων, αποτελείται από τρεις υπομονάδες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια gate, gatA και gatB. Σε μερικά αρχαία, ol αμιδοτρανσφεράσες είναι ετεροδιμερή μόρια και κωδικοποιούνται από τα γονίδια gatD και gatE. Σε αντίθεση, με την αμιδοτρανσφεράση gatCAB, η οποία έχει διπλή δράση Asp-AdT και Glu-AdT δηλαδή καταλύει τη μετατροπή του AsptRNAAsn σε Asn-tRNAAsn και του Glu-tRNAGln σε Gln-tRNAGln αντίστοιχα, η αμιδοτρανσφεράση gatDE έχει δράση μόνο Glu-AdT. Η παρούσα εργασία περιλαμβάνει πειράματα κλωνοποίησης των γονιδίων gatC, gatA και gatB του παθογόνου βακτηρίου Helicobacter pylori και του αρχαίου Methanococcus jannaschii. Ακολούθησε ο σχηματισμός των οπερονίων και η κλωνοποίησή τους σε φορέα έκφρασης.