Καθαρισμός και κρυστάλλωση της m5U μεθυλτρανσφεράσης του tRNA από το αρχαίο Pyroccocus abyssi και από το βακτήριο Bacillus subtilis

Abstract

Η μεθυλίωση της ουρακίλης στη θέση 54 (βρόγχος Τ) στο tRNA είναι παρούσα και στα τρία βασίλεια της ζωής (Βακτήρια, Ευκαρυώτες και Αρχαία), αποτελώντας μια ενδιαφέρουσα εστία μελέτης της εξελικτικής καταγωγής της τροποποιητικής διαδικασίας του μεταφορικού RNA. Ένας τρόπος προσέγγισης είναι η κρυστάλλωση των πρωτεϊνών που καταλύουν αυτή την αντίδραση και η μελέτη και σύγκριση των τρισδιάστατων δομών τους. Έτσι επελέχθησαν δύο τροποποιητικά ένζυμα από δύο διαφορετικούς οργανισμούς (η πι5υ54ΜΤάση από Pyroccocus abyssi και από Bacillus subtilis) τα οποία μεθυλιώνουν τη θέση 54 με χρήση διαφορετικών συμπαραγόντων (η πρώτη το συνένζυμο SAM και η δεύτερη το 5,10 μεθυλ-τετραφολικό οξύ). Αρχικά έγινε υπερέκφραση και καθαρισμός των πρωτεϊνών με χρήση χρωματογραφίας συγγένειας και ακολούθως με άλλες χρωματογραφίες καθαρισμού (χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής (στήλες MonoS και MonoQ), χρωματογραφία μοριακής διήθησης, στήλη Υδροξυαπατίτη). Παρατηρήθηκε ότι με τη χρήση αυτών των στηλών δεν επέρχεται ιδιαίτερη αλλαγή στην καθαρότητα και των δύο πρωτεϊνών. Ακολούθησε η συμπύκνωση των πρωτεϊνών ώστε να επιτευχθεί η κατάλληλη συγκέντρωση για να μπορέσουν να πραγματοποιηθούν οι δοκιμές κρυστάλλωσης. Η ιτι5υ54ΜΤάση από Ρ. abyssi συμπυκνώνεται επιτυχώς στα 1 8mg/ml ενώ το στάδιο αυτό παραβλέπεται για την πι5υ54ΜΤάση από Β. subtilis λόγω του ήδη υψηλού βαθμού έκφρασής της μετά τη χρωματογραφία συγγένειας (36mg/ml). Επίσης διεξήχθησαν ενζυμικές δοκιμές για ανίχνευση ριβονουκλεασών, ώστε να διαπιστωθεί εάν οι πρωτεΐνες είναι αρκετά απαλλαγμένες από ριβονουκλεάσες ώστε να είναι δυνατή η κρυστάλλωση συμπλοκών με tRNA. Όσον αφορά τα αποτελέσματα κρυστάλλωσης, τόσο δείγματα της Γη5υ54ΜΤάσης από Ρ. abyssi όσο και της πι51)54ΜΤάσης από Β. subtilis κρυσταλλώθηκαν, ενώ ένας από τους κρυστάλλους (ιτι5υ54ΜΤάση από Ρ. abyssi + SAM) σκέδασε με διακριτική ικανότητα 2,5Α.