Υπερέκφραση και καθαρισμός των ανασυνδυασμένων μορφών των πρωτεϊνών Arc1p, MetRS και GluRS του Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Το μεταφορικό RNA (tRNA) αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους παράγοντες στην αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας. Από την ακρίβεια της αντίδρασης ομοιοπολικής δέσμευσης του συγκεκριμένου μορίου με το συγγενές αμινοξύ, η οποία καταλύεται από τις αμινοάκυλο-tRNA συνθετάσες, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό η πιστότητα της μετάφρασης του γενετικού κώδικα. Στο ζυμομύκητα έχει ανακαλυφθεί η ύπαρξη ενός συμπλόκου που αποτελείται από δύο ένζυμα, τις αμινοάκυλο-tRNA συνθετάσες της μεθειονίνης (MetRS) και της γλουταμίνης (GluRS), καθώς και από την πρωτεΐνη Arclp (Aminoacyl-tRNA synthetase cofactor 1). H Arclp συνδέεται με τις αμινο-τελικές «προσαρτήσεις» των δύο ενζύμων και υποβοηθά την καταλυτική τους δραστικότητα αυξάνοντας την αγχιστεία τους για τα συγγενή μόρια tRNA (tRNAMetKai tRNAGlu). Στην παρούσα πειραματική εργασία, υπερεκφράσαμε την πρωτεΐνη Arclp σε βακτήρια [στέλεχος BL21(DE3)] και τα ένζυμα GluRS και MetRS σε κύτταρα ζύμης (στέλεχος RS453). Μετά τον μετασχηματισμό των βακτηριακών κυττάρων και των κύτταρων ζύμης με τα κατάλληλα πλασμίδια και την καλλιέργειά τους, ακολούθησε η επαγωγή της έκφρασης των πρωτεϊνών - της μεν Arclp με ισοπροπυλοθειογαλακτοζίτη (IPTG) και των δε ενζύμων με γαλακτόζη. Ακολούθησε ο καθαρισμός των πρωτεϊνών με τη χρήση χρωματογραφίας συγγένειας. Οι στήλες που χρησιμοποιήθηκαν έφεραν νικέλιο (Νϊ-ΝΤΑ), το οποίο και σχηματίζει χηλική ένωση με το ημιδαζόλιο των ιστιδινών (His-tag). Η επιλογή έγινε επειδή και οι τρεις υπό μελέτη πρωτεΐνες περιέχουν στο αμινοτελικό τους άκρο μια ουρά ιστιδινών (8His-tag για τις GluRS και MetRS και 6His-tag για την Arclp). Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμίδης και η ανίχνευση των ζωνών έγινε με τη χρώση Coomassie Blue καθώς και με επώαση με αντισώματα (Arclp). Παρατηρήθηκε ότι η επαγωγή της έκφρασης και ο καθαρισμός των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκαν με επιτυχία. Δεν ισχύει όμως το ίδιο και για την προσπάθεια ποσοτικού προσδιορισμού της συμπλοκοποίησης των τριών αυτών πρωτεϊνών με τη χρήση ηλεκτροφόρησης σε μη-αποδιατακτικές συνθήκες (Non-denaturing Electrophoresis).