Αξιολόγηση της μικροσφαιριδιακής κυτταρομετρικής τεχνολογίας στην HLA-A*, -B*, -DRB1* τυποποίηση σε σύγκριση με την κλασσική μέθοδο γονιδιακής τυποποίησης PCR-SSP (PCR με χρήση ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών αφετηριών)

Abstract

Από τις περισσότερες μελέτες που πραγματοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια με τη χρήση μοριακών τεχνικών για την τυποποίηση των HLA μορίων τάξης I και II, αποδείχθηκε αναμφίβολα μια σημαντική ποιοτική διαφορά σε σχέση με την κλασσική ορολογική τυποποίηση. Όλες οι ορολογικά προβληματικές τυποποιήσεις αποσαφηνίστηκαν και όλα τα άγνωστα αλλήλια μπόρεσαν να τυποποιηθούν. Με την εφαρμογή των μοριακών τεχνικών και στον τομέα των μεταμοσχεύσεων αποδείχθηκε ο ρόλος των HLA-A*, -Β*, -DRB1* αντιγόνων στην καλύτερη επιβίωση του μοσχεύματος. Στη παρούσα εργασία τυποποιήθηκαν για τα HLA-A*, -Β*, -DRB 1 * αλλήλια, με DNA τεχνικές, 278 υγιή άτομα, τα οποία ανήκουν στον επίμικτο Θεσσαλικό πληθυσμό, με απώτερο σκοπό την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων τόσο στον τομέα των μεταμοσχεύσεων, όσο και σε διάφορες πληθυσμιακές μελέτες. Οι δύο μοριακές μέθοδοι που εφαρμόστηκαν ήταν η μεγέθυνση του DNA με PCR και χρήση ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών αφετηριών (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Primers, PCR-SSP) και ο υβριδισμός με συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μετά από μεγέθυνση του DNA με PCR με χρήση της μικροσφαιριδιακής κυτταρομετρικής τεχνολογίας LIFEMATCH (PCR-SSO LIFEMATCH). Κατ'αρχήν έγινε απομόνωση του DNA από όλα τα άτομα της μελέτης. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του DNA περιλάμβανε τη χρήση διαφόρων απορρυπαντικών, πρωτεϊνάσης Κ και αιθανόλης. Για την PCR-SSP ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν 24 διαφορετικά ζεύγη αφετηριών για κάθε άτομο για την αναγνώριση των Α* αλληλίων, 48 ζεύγη αφετηριών για την αναγνώριση των Β* αλληλίων και 23 ζεύγη αφετηριών για την αναγνώριση των DRB1* αλληλίων. Με την εμφάνιση ή όχι προϊόντος PCR στην ηλεκτροφόρηση που ακολουθούσε γινόταν η τυποποίηση των HLA τάξης I και II μορίων για κάθε άτομο. Στην PCR-SSO LIFEMATCH ανάλυση, το μεγεθυσμένο PCR προϊόν αφήνονταν να υβριδιστεί με ένα μίγμα ιχνηθετημένων ολιγονουκλεοτιδίων, όπου κάθε ολιγονουκλεοτίδιο ήταν ομόλογο προς μία αλληλουχία, μοναδική σε ένα αλληλόμορφο ή μια ομάδα αλληλομόρφων. Η ανάλυση της αντίδρασης γινόταν στον Φθοριοαναλυτή LIFEMATCH καθώς τα μικροσφαιρίδια, στην επιφάνεια των οποίων ήταν προσαρτημένα τα ολιγονουκλεοτίδια (με ή χωρίς το αλλήλιο), περνούσαν ένα-ένα από δύο laser, ένα κόκκινο που ανίχνευε την αντίδραση και ένα πράσινο που μετρούσε την αντίδραση.