Κλωνοποίηση, έκφραση, καθαρισμός και ενζυμικές δοκιμές της 5-μεθυλ-τρανσφεράσης του tRNA του αρχαίου Pyrococcus Abyssi - ταυτοποίηση του γονιδίου για την κωδικοποίηση της 5-μεθυλ-τρανσφεράσης του tRNA στο βακτήριο Bacillus Subtilis

Abstract

Η μετα-μεταγραφική τροποποίηση 5-μεθυλ-ουρακίλη (m5U) εντοπίζεται στη βρόγχο Τ (θέση 54) των περισσότερων μορίων tRNA σε οργανισμούς των τριών Βασιλείων (Βακτήρια, Ευκαρύωτες και Αρχαία). Στο γονιδίωμα του αρχαίου Pyrococcus abyssi εντοπίζεται ένα ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ΡΑΒ0719, Genebank) που κωδικοποιεί την m5U μεθυλ-τρανσφεράση των μορίων tRNA. Το συγκεκριμένο πλαίσιο ανάγνωσης εντοπίστηκε λόγω της ομολογίας του με ανάλογα γονίδια στο βακτήριο Escherichia coli (trmA) και στον ευκαρυώτη Saccharomyces cerevisiaea (trm2). Το γονίδιο κλωνοποιήθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας ζεύγος εκκινητών με υψηλή ομολογία προς το 5' και το 3' άκρο της αλληλουχίας-στόχου και συνδέοντας το γονίδιο με ένα φορέα έκφρασης, ο οποίος σε κύτταρα E.coti επιτρέπει την έκφραση μιας ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με μοριακό βάρος 49 kDa. Ο καθαρισμός της τελευταίας επιτυγχάνεται με χρωματογραφία συγγένειας. Η δραστικότητα του ενζύμου ως m5U μεθυλ- τρανσφεράση ελέγχεται in vitro. Ως συνένζυμο της συγκεκριμένης in vitro δοκιμής χρησιμοποιείται η S-αδένινο-ί. μεθειονίνη (S- adenosyl- L- methionine). Η τροποποίηση m5U δεν ανιχνεάεται στα μόρια tRNA του στελέχους BFS2838 του βακτηρίου Bacillus subtilis. Το συγκεκριμένο στέλεχος φέρει μετάλλαξη στο γονίδιο gid. Η έλλειψη δραστικότητας του ενζύμου ανιχνεύεται με δοκιμή in vitro χρησιμοποιώντας ως πηγή του ενζύμου κυτταρικό εκχύλισμα από το μεταλλαγμένο στέλεχος BFS2838, ενώ ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιείται κυτταρικό εκχύλισμα από το αγρίου τύπου στέλεχος W168 του B.subtilis. Ft σύσταση της αντίδρασης περιλαμβάνει μια σειρά από συνένζυμα: τετραφολικό οξύ (TFIF), ανηγμένη μορφή του φλάβινο- αδένινο- δινουκλεοτιδίου (FADH2) και ανηγμένη μορφή φωσφορικού νικοτινάμινο- αδένινο- δινουκλεοτιδίου (NADPH).