Κλωνοποίηση, έκφραση και καθαρισμός της αμιδοτρανσφεράσης του γλουταμινικού οξέος από το αρχαίο pyroccocus abyssi

Abstract

Η αμινοακυλίωση των μορίων tRNA, όντας μια από τις κυρτότερες κυτταρικές διεργασίες, πραγματοποιείται μέσω δυο βιοχημικών οδών στους οργανισμούς. Η μια οδός αφορά την άμεση αμινοακυλίωση των tRNA μορίων με τα αμινοξέα, μέσω της δράσης των αμινοάκυλο-tRNA συνθετασών. Ορισμένοι, όμως, οργανισμοί χρησιμοποιούν, για την εστεροποίηση κάποιων tRNA με τα αντίστοιχα αμινοξέα, ένα έμμεσο βιολογικό μονοπάτι που περιλαμβάνει την λειτουργία μιας μη εξειδικευμένης συνθετάσης και μιας αμιδοτρανσφεράσης (AdT). Τα ένζυμα AdT κωδικοποιούνται, στα βακτηριακά κύτταρα και στα οργανίδια των ευκαρυωτικών οργανισμών, από το οπερόνιο gatCAB. Αντίθετα, στα αρχαία οι αμιδοτρανσφεράσες κωδικοποιούνται από τα γονίδια gatD και gatE, τα οποία βρίσκονται σε γειτονικές θέσεις στο γονιδίωμα των κυττάρων αυτών σχηματίζοντας το οπερόνιο gatDE. Τα γονίδια gatD και gatE μεταφραζόμενα συνθέτουν την αμιδοτρανσφεράση του γλουταμινικού οξέος, η οποία εμπλέκεται στη δημιουργία του Gln-tRNAGln. Εδώ αναφέρεται η προσπάθεια κλωνοποίησης και υπέρ-έκφρασης των δυο αυτών γονιδίων σε στελέχη του E.coli, καθώς και ο καθαρισμός με χρωματογραφία της υπομονάδας gatD του οπερονίου. Επίσης, δοκιμάστηκε η κλωνοποίηση και η έκφραση ολόκληρου του οπερονίου σε κατάλληλους φορείς και κύτταρα.