Προκαταρκτικές μελέτες επί της επιδιορθωτικής δραστικότητας της αμινοάκυλο-tRNA συνθετάσης της φαινυλαλανίνης

Abstract

Η πρωτεϊνοσύνθεση είναι μια θεμελιώδης διεργασία που εξασφαλίζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η ορθότητά της επιτυγχάνεται με τη σωστή αμινοακυλίωση των μορίων tRNA και την αλληλεπίδραση κωδικονίου- αντικωδικονίου. Τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση των σωστών αμινοάκυλο-tRNA μορίων είναι οι αμινοάκυλο-tRNA συνθετάσες. Τα ένζυμα αυτά παρουσιάζουν υψηλή εξειδίκευση και έχουν αναπτύξει επιδιορθωτικούς μηχανισμούς κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Η αμινοάκυλο-tRNA συνθετάση της φαινυλαλανίνης (PheRS) ανήκει στην κλάση II και είναι ένα τετραμερές ένζυμο με δομή (αβ)2· Η PheRS ενεργοποιεί σε κάποιες περιπτώσεις το αμινοξύ τυροσίνη, αλλά έχει τη δυνατότητα να επιδιορθώσει το σφάλμα αυτό. Ο ακριβής μηχανισμός επιδιόρθωσης δεν έχει ακόμα ταυτοποιηθεί. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η προετοιμασία των κατάλληλων παραγόντων για τη μελέτη και αποκάλυψη του μηχανισμού αυτού. Για τη μελέτη αυτή ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε το τμήμα του γενωμικού DNA του E.coli το οποίο εμπεριέχει τα γονίδια που κωδικοποιούν τις υπομονάδες α και β της PheRS και φέρει τη μετάλλαξη A294G στο γονίδιο που κωδικοποιεί την α υπομονάδα. Η μετάλλαξη αυτή είναι κρίσιμη για την εξειδικευμένη επιλογή αμινοξέων από τη συνθετάση. Ακολούθως, επιχειρήθηκε η έκφραση των γονιδίων αυτών. Επιπλέον ενισχύθηκαν και κλωνοποιήθηκαν το γονίδιο που κωδικοποιεί την α υπομονάδα της PheRS του M.thermoautotrophicum και ένα γονίδιο που παρουσιάζει υψηλή ομολογία με εκείνο που κωδικοποιεί τη β υπομονάδα της PheRS και έγινε προσπάθεια να τεθούν υπό την επίδραση του ίδιου προαγωγέα. Τέλος, ενισχύθηκε και κλωνοποιήθηκε το γονίδιο που κωδικοποιεί την TyrRS του G.stearothermophilus και επιχειρήθηκε η εισαγωγή θέση-κατευθυνόμενών μεταλλάξεων στο κατάλοιπο 152 από γλουταμινικό οξύ σε αλανίνη και αργινίνη. Η μεταλλαγμένη συνθετάση εστεροποιεί τυροσίνη στο tRNA της φαινυλαλανίνης και είναι κατάλληλη για να παρέχει τα απαραίτητα υποστρώματα για in vitro μελέτες της επιδιορθωτικής δράσης της PheRS.