Εφαρμογή επαναδιασταυρώσεων μεταξύ εμπορικών ποικιλιών και διειδικών υβριδίων βαμβακιού και γενετική ανάλυση με χρήση μοριακών δεικτών τύπου rapds

Abstract

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας αξιολογήθηκε η συνδυαστική ικανότητα μεταξύ εμπορικών ποικιλιών και διειδικών υβριδίων βαμβακιού και εφαρμόστηκαν μοριακοί δείκτες τύπου RAPD για την γενετική ανάλυση τόσο των μητρικών ποικιλιών όσο και των απογόνων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η εγκατάσταση του πειράματος στον αγρό τηρώντας όλες τις απαραίτητες καλλιεργητικές φροντίδες κατά την διάρκεια του έτους 2008-2009. Στα διάφορα στάδια ανάπτυξης των φυτών λαμβάνονταν μετρήσεις και παρατηρήσεις όσο αναφορά την φυτρωτική ικανότητα και κυρίως είχαν σαν αντικειμενικό σκοπό τη συλλογή πληροφοριών για την αναγνώριση των φαινοτύπων που διέθεταν χαρακτηριστικά του G. hirsutum, G. barbadense ή συνδυασμό των δυο αυτών ειδών. Ακολούθησε η εφαρμογή των διασταυρώσεων (ξεκίνησαν 22/07/2008 και ολοκληρώθηκαν 10/08/2008) και πρέπει να αναφέρουμε ότι η όλη διαδικασία γίνεται μόνο κατά τις πρώτες πρωινές ώρες έτσι ώστε να αποφύγουμε τυχόν φυσικές επικονιάσεις (έντομα). Επίσης η επιλογή των ανθών γίνεται όταν αυτά βρίσκονται στο στάδιο της κορώνας. Στην συνέχεια, περιλάβαμε τους καρπούς-σπόρους που πρόεκυψαν από τις επιτυχείς διασταυρώσεις (απογόνους) και πραγματοποιήσαμε νέα σπορά στον χώρο στου εργαστηρίου και μέσα σε Jiffy pellets. Έχοντας στην διάθεση μας φυτικό υλικό τόσο από τους γονείς όσο και από τους απογόνους των διασταυρώσεων ξεκίνησε η γενετική ανάλυση με χρήση μοριακών δεικτών. Αρχικά απομονώθηκε το γενετικό υλικό των 17 γενοτύπων σύμφωνα με την CTAB μέθοδο για απομόνωση ολικού DNA και ακολούθησε η πέψη RNA (remove RNA) για να βελτιώσουμε την ποιότητα του γενετικού μας υλικού. Για την βελτιστοποίηση των συνθηκών αντίδρασης κρίθηκε αναγκαίος ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του DNA των δειγμάτων και των εκκινητών με χρήση του Nanodrop. Η ανάλυση κατά RAPDs αποδείχτηκε ιδιαίτερα αξιόπιστη για το γενετικό υλικό του πειράματος και εμφάνισαν υψηλή διακριτική ικανότητα. Έπειτα από αρκετές δοκιμές και αφού βελτιστοποιήσαμε τις συνθήκες αντίδρασης καταλήξαμε στους πιο πολυμορφικούς δείκτες, οι οποίοι είναι οι ΟΡΕ-02, ΟΡΕ-17, ΟΡΙ-04, ΟΡΙ-07, OPJ- 04, OPJ-06, OPC-19, OPC-11, OPC-13, ΟΡΒ-16, ΟΡΒ-17 και ΟΡΑ-08. Πολυμορφισμοί ανιχνεύτηκαν μόνο σε 12 εκκινητές. Συγκεκριμένα μόνο 10 εκκινητές ενίσχυσαν ζώνες και παρουσίασαν πολυμορφισμούς και στους 17 γενότυπους βαμβακιού. Επίσης, παρατηρήθηκαν 307 ζώνες και οι πολυμορφισμοί που κατεγράφησαν φτάνουν τους 34. Τέλος, ακολούθησε η δημιουργία του δενδρογράμματος φυλογενετικών σχέσεων. Μόνο λίγοι γενότυποι εμφάνισαν την αναμενόμενη γενετική συγγένεια η οποία βασίζεται στην γενεαλογία του φυτικού υλικού. Η πλειοψηφία των γενότυποι εμφάνισαν μεταξύ τους και σε αρκετά σημεία, ανεξήγητη γενετική συγγένεια. Η στενή γενετική σχέση μερικών γενοτύπων δεν επιβεβαιώνεται από τα μορφολογικά τους γνωρίσματα ή την αγρονομική τους συμπεριφορά. Η περίπτωση αυτών των γενοτύπων προτείνεται να εξεταστεί εκ νέου.