Μελέτες στη βιολογική σημασία της ανθρώπινης αποαδενυλάσης CNOT7

Abstract

Η ακριβής γονιδιακή έκφραση απαιτεί συνεχή έλεγχο των επιπέδων του mRNA. Η αποικοδόμηση του mRNA αποτελεί ρυθμιστικό στοιχείο της γονίδιακής έκφρασης. Στα κύτταρα των θηλαστικών το κύριο μονοπάτι αποικοδόμησης ξεκινά με αποαδενυλίωση, την αφαίρεση δηλαδή των πολύ(Α) ουρών από το 3' άκρο ενός ώριμου mRNA. Η βράχυνση της ουράς καταλύεται από ένζυμα γνωστά ως αποαδενυλάσες. Ο ρόλος της ύπαρξης πολλών τέτοιων ενζύμων που επιτελούν τη συγκεκριμένη διεργασία δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί. Επιχειρούμε να προσεγγίσουμε το ερώτημα αυτό, αποσιωπώντας τις αποαδενυλάσες και αναλύοντας την επίδρασή της στα επίπεδα έκφρασης επιλεγμένων mRNAs. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η επίδραση της αποσιώπησης της ανθρώπινης CNOT7 στα επίπεδα έκφρασης επιλεγμένων παραγόντων, στα πλαίσια μιας πρώτης προσπάθειας για τον προσδιορισμό των mRNA-στόχων της κάθε αποαδενυλάσης. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάσαμε 5 κατάλληλα shRNAs για την ειδική σίγηση της CNOT7 και με αυτά διαμολύναμε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα Hep2. Με ανοσοαποτύπωση και ποσοτική Real Time PCR ελέγξαμε σε επίπεδο πρωτεϊνών και mRNA αντίστοιχα, την επιτυχία της αποσιώπησης και τα επίπεδα έκφρασης των εξεταζόμενων παραγόντων σε εκχυλίσματα κυττάρων αγρίου τύπου και κυττάρων διαμολυσμένων με τα shRNAs. Σύγκριση των προτύπων έκφρασης μετά από αποσιώπηση της ΟΝΟΤ7με τα αντίστοιχα από την αποσιώπηση άλλων σημαντικών αποαδενυλασών όπως η PARN, φανερώνει κάποια διαφορετικότητα όσων αφορά τουλάχιστον σε ορισμένα mRNAs.