Διερεύνηση νέων μοριακών αλληλεπιδράσεων της υπομονάδας HIF-1α του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-1 : η πρωτεΐνη HAX-1

Abstract

Ο μεταγραφικός παράγοντας HIF-1 αποτελεί την κύρια απόκκριση του κυττάρου όταν αυτό εκτεθεί σε συνθήκες μειωμένων συγκεντρώσεων οξυγόνου (υποξία). Πρόκειται για ένα ετεροδιμερή παράγοντα ο οποίος αποτελείται από δύο υπομονάδες, την α και τη β. Η ρύθμιση του HIF-1 συντελείται μέσω της α υπομονάδας (HIF-la) , η έκφραση της οποίας εξαρτάται από την ενδοκυτταρική συγκέντρωση οξυγόνου. Η ενεργοποίηση του HIF-1 σηματοδοτεί την έκφραση γονιδίων τα προϊόντα των οποίων δρουν αντιρροπιστικά στο υποξικό στρες. Γίνεται φανερό λοιπόν, ότι ο HIF-1 εμπλέκεται σε μονοπάτια ερυθροποίησης, αγγειογένεσης, μεταβολισμού και κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ωστόσο, για τη λειτουργία του HIF-1 αναγκαία κρίνεται η συσχέτισή του και με άλλα μόρια. Το σύστημα των δύο υβριδίων ήταν αυτό που επιλέχθηκε ως γρήγορο και αξιόπιστο για την ανίχνευση των μορίων αυτών με τον HIF-la [1], Έτσι, ανάμεσα στις διάφορες μοριακές αλληλεπιδράσεις που ανιχνεύτηκαν συμπεριλαμβάνεται και αυτή με την πρωτεΐνη ΗΑΧ-149 "46. Η ΗΑΧ-1 ταυτοποιήθηκε αρχικά ως μία πρωτεΐνη 35 kDa η οποία φυσιολογικά εκφράζεται σε όλους τους ιστούς. Αλλη/.επιδρά με διάφορα μόρια και εμπλέκεται σε διάφορα μονοπάτια, το πιο καλά μελετημένο από τα οποία είναι αυτό των κασπασών 3 και 9 όπου και έχει αντιαποπτωτική δράση. Επιπρόσθετα, έχει αποδειχτεί ότι μεταλλάξεις στο γονίδιό της προκαλούν ουδετεροπενία [Severe Congenital Neutropenia (SCN)], ενώ υποθέσεις έχουν γίνει για συσχέτισή της και με άλλες ασθένειες όπως η ψωρίαση, η πολυκυστική νόσος των νεφρών, ο καρκίνος κ.α. Σκοπός της διπλωματικής αυτής εργασίας ήταν η έκφραση και ο καθαρισμός των πρωτεϊνών ΗΑΧ-149'246 και HIF-la244oj2 και η in vitro επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης τους, καθώς το σύστημα δύο υβριδίων αν και κατάλληλο για την ανίχνευση αγνώστων αλληλεπιδράσεων, παρ όλα αυτά είναι ένα ετερόλογο σύστημα το οποίο χρειάζεται επαλήθευση. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση του cDNA της ΗΑΧ-149 246 σε πλασμιδιακό φορέα έκφρασης πρωτεϊνών (pGEX4Tl-Tev) και ακολούθησε επαγωγή και καθαρισμός της ΗΑΧ-149'246 και του HIF-la244'532 (παράλληλα καθαρίστηκαν και πρωτεΐνες οι οποίες αποτέλεσαν, τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες της πειραματικής διαδικασίας). Τελικά πραγματοποιήθηκε επιτυχής in vitro ειδική σύνδεση (pull down assay) των δύο πρωτεϊνών ενώ τα αποτελέσματα της σύνδεσης αυτής αναλύθηκαν με τη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης με τη βοήθεια ειδικών αντισωμάτων. Επιβεβαιώθηκε δηλαδή η in vitro σύνδεση της πρωτεΐνης ΗΑΧ-149 246 με τον HIF-la.