Υπερέκφραση και απομόνωση της ανθρώπινης poly(A) - δεσμεύουσας πρωτεϊνης - PABP1 - από κύτταρα βακτηρίων

Abstract

Πραγματοποιήθηκε ερευνητική μελέτη για τον καθορισμό των βέλτιστων συνθηκών υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΡΑΒΡ (polyA-binding protein 1) του ανθρώπου σε βακτηριακά κύτταρα Ε. coli ως ανασυνδυασμένη χιμαιρική πρωτεΐνη με GST ετικέτα στο Ν-τελικό άκρο. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ο καθαρισμός της από ολικό εκχύλισμα βακτηριακών πρωτεϊνών, η πέψη της με πρωτεάση 3C για την απομάκρυνση της GST ετικέτας καθώς επίσης και έλεγχος της δευτεροταγούς δομής της ανσυνδυασμένης ΡΑΒΡ με βιοφυσικές μεθόδους. Μελέτες για την βέλτιστη παραγωγή της ΡΑΒΡ πρωτεΐνης έγιναν χρησιμοποιώντας διάφορες κυτταρικές σειρές Ε. coli, καθώς και ένα φάσμα συγκεντρώσεων IPTG, θερμοκρασιών ανάπτυξης και χρόνων επαγωγής έκφρασης. Ο καθαρισμός της χιμαιρικής GST-ΡΑΒΡ πρωτεΐνης από κύτταρα βακτηρίων έγινε με την τεχνική της χρωματογραφίας χημικής συγγένειας και τη χρήση σφαιριδίων συζευγμένων με GH (γλουταθειόνη). Ο βιοφυσικός προσδιορισμός της δευτεροταγούς δομής της ΡΑΒΡ πρωτεΐνης ,έγινε με φασματοπολωσιμετρία κυκλικού διχραπσμού (CD) .