Έκφραση, καθαρισμός και δομικές μελέτες της ανασυνδυασμένης poly(A) -specific ribonuclease (PARN)

Abstract

Η ριβονουκλεάση PARN είναι μια 3 -εξωριβονουκλεάση, ειδική στην poly(A) περιοχή, η οποία συμβάλλει στην αναδιοργάνωση του ευκαρυωτικού mRNA και λόγω αυτού εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων. Η ανθρώπινη πρωτεΐνη PARN αποτελείται από 639 αμινοξέα. Η κρυσταλλική δομή του C-τελικού άκρου της ανθρώπινης PARN (αμινοξέα 1-430), που ονομάζεται PARNn, έχει προσδιοριστεί σε δύο καταστάσεις (ελεύθερη και δεσμευμένη στο RNA) και απεκάλυψε ότι η PARN αναδιπλώνεται σε δύο περιοχές: την R3H και την περιοχή νουκλεάσης. Η PARNn είναι ένα συμπαγές ομοδιμερές, στο οποίο η R3H περιοχή της μιας υπομονάδας περιβάλλει το ενεργό κέντρο του ενζύμου στην άλλη υπομονάδα. Το υπόστρωμα poly(A), συνδέεται σε μια βαθιά κοιλότητα της περιοχής- νουκλεάσης, με τρόπο ο οποίος είναι ανεξάρτητος από την νουκλεοτιδική αλληλουχία. Η R3H περιοχή και πιθανόν η cap-δεσμευμένη περιοχή εμπλέκονται στην δέσμευση του υποστρώματος, αν και δεν φαίνεται να συμβάλλουν στην εξειδίκευση του ενζύμου. Μεταλλαγές που εμποδίζουν το διμερισμό, καταστέλλουν την ενζυμική δραστικότητα και εμποδίζουν την δέσμευση της πρωτεΐνης στο RNA, υποδηλώνοντας ότι το διμερές της PARN αποτελεί μια ανεξάρτητη δομική και λειτουργική μονάδα. Στην παρούσα πτυχιακή εργασία διεξήχθη έκφραση και καθαρισμός των διαλυτών μορφών των ανασυνδυασμένων ανθρώπινων πρωτεϊνών, PARN και PARN (αμινοξέα 1-523), που ονομάζεται PARNt. Οι δύο πρωτεΐνες εκφράστηκαν χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο ρΕΤ33 σε κύτταρα BL21(DE3) του βακτηρίου E.coli και απομονώθηκε lmg πρωτεΐνης ανά 1 λίτρο καλλιέργειας. Το πρωτόκολλο καθαρισμού περιλάμβανε χρωματογραφία συγγένειας (His-tag affinity), χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής HiTrap QFF και χρωματογραφία συγγένειας 7-Me-GTP-Sepharose. Το πρωτόκολλο καθαρισμού οδήγησε στην απομόνωση δείγματος με βαθμό καθαρότητας 90-95%. Πειράματα Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS) έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη PARN στο διάλυμα είναι ένα τετραμερές. Επίσης διεξήχθη σάρωση με αυτοματοποιημένο σύστημα κρυστάλλωσης περισσότερων από 200 διαφορετικών συνθηκών κρυστάλλωσης η οποία οδήγησε στον προσδιορισμό των συνθηκών κρυστάλλωσης για τις PARN και PARNt.