Έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της α1 υπομονάδας του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης σε βακτηριακά στελέχη E. coli

Abstract

Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης ανήκουν στην υπεροικογένεια των προσδετοελεγχόμενων ιοντικών διαύλων, οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την παρουσία μίας συντηρημένης κυστεϊνικής θηλιάς (cl-LGICs ) και διακρίνονται σε νευρομυϊκού και νευρικού τύπου. Ο νευρομυϊκός υποδοχέας σχηματίζει ένα πενταμερές με σταθερή στοιχειομετρία (α1)2(β1)εδ στα ενήλικα άτομα και (α1)2(β1)γδ στον εμβρυϊκό οργανισμό και διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στη μεταγωγή σήματος στη νευρομυϊκή σύναψη, όπου και εντοπίζεται. Η Βαριά Μυασθένεια αποτελεί ένα αυτοάνοσο νόσημα όπου τα αντισώματα που παράγονται από το ανοσοποιητικό σύστημα, κατευθύνονται κατά των νευρομυϊκών υποδοχέων της ακετυλοχολίνης στη νευρομυϊκή σύναψη. Ως αποτέλεσμα παρατηρείται μείωση του αριθμού των υποδοχέων στις νευρομυϊκές συνάψεις με αποτέλεσμα τη διακοπή της μεταγωγής σήματος και την εμφάνιση παθολογικών χαρακτηριστικών. Λόγω της μη ύπαρξης ολοκληρωμένης θεραπευτικής προσέγγισης, η ανάγκη για εξειδικευμένη απομάκρυνση των αντισωμάτων που στρέφονται κατά των υποδοχέων, οδήγησε στην ιδέα ανοσοπροσρόφησης των αντισωμάτων με χρήση ανασυνδυασμένων τμημάτων του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (.Δίπλωμα Ευρεσιτεχνίας Tzartos et.al., 2002). Αυτό προϋποθέτει την παραγωγή των εξωκυτταρικών τμημάτων σε μεγάλες ποσότητες, διατηρώντας την ικανότητα τους να αναγνωρίζονται από τα παθολογικά αντισώματα. Υπάρχει μία πληθώρα συστημάτων έκφρασης με το εντεροβακτήριο E.coli να αποτελεί ένα από τα ευρέως διαδεδομένα συστήματα έκφρασης ετερόλογων γονιδίων. Η παρούσα εργασία, στόχο είχε την έκφραση του εξωκυτταρικού τμήματος της α1 υπομονάδας του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, σε στελέχη E.coli. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα Rosetta, Origami, BL21 και C41 ενώ το υπό εξέταση γονίδιο ήταν κλωνοποιημένο σε έναν ρΕΤ φορέα. Η έκφραση όμως της πρωτεΐνης στους συγκεκριμένους ξενιστές δεν είχε ως αποτέλεσμα την απόκτηση διαλυτής πρωτεΐνης, καθώς δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα στάδιο της εργασίας σε κάποιο αντίστοιχο κλάσμα, όταν οι χειρισμοί γίνονταν υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες. Η πρωτεΐνη ήταν εγκλωβισμένη μέσα σε συσσωματώματα, αν και οι ξενιστές που χρησιμοποιήθηκαν διέθεταν γενετικά τροποποιημένα χαρακτηριστικά, ώστε να εμπλουτίσουν την υπό παραγωγή πρωτεΐνη με κάποια από τα σημαντικότερα στοιχεία που εμφανίζονται όταν η πρωτεΐνη εκφράζεται in vivo (προσθήκη σπάνιων κωδικονίων, σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών). Στη συνέχεια, ακολούθησε απομόνωση της πρωτεΐνης υπό αποδιατακτικές συνθήκες. Η έκφραση με αυτόν τον τρόπο είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή της πρωτεΐνης σε συγκεντρώσεις των 0.896 mg/L για το βακτηριακό στέλεχος Rosetta, 2.48 mg/L για το βακτη- ριακό στέλεχος Origami, 0.632 mg/L για το βακτηριακό στέλεχος BL21 και 1.36 mg/L για το βακτηριακό στέλεχος C41. Παρά την αποδιατεταγμένη μορφή της πρωτεΐνης, σε πειράματα ανοσοπροσρόφησης και RIA που ακολούθησαν μετά την απομόνωση και τον καθαρισμό της από στήλη νικελίου, η πρωτεΐνη ήταν ικανή να προσδέσει παθολογικά αντισώματα και να τα απομακρύνει από ορούς ασθενών που πάσχουν από μυασθένεια. Η παρατήρηση αυτή, καθιστά το εντεροβακτήριο E.coli ένα εξαιρετικό σύστημα έκφρασης του εξωκυτταρικού τμήματος της ατ υπομονάδας του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, όταν η παραγόμενη πρωτεΐνη προορίζεται να χρησιμοποιηθεί για κατασκευή στήλης με σκοπό την ειδική απομάκρυνση των αυτοαντισωμάτων που παράγονται κατά την ανάπτυξη του νοσήματος της μυασθένειας.