dc.description.abstract | Οι χημειοκίνες, μικρές χημειοτακτικές κυτταροκίνες, αποτελούν τους βασικούς
ρυθμιστές της μετανάστευσης των κυττάρων. Ο προερχόμενος από κύτταρα του
στρώματος παράγοντας-1 (Stromal cell-derived factor-1 / SDF-1), είναι μια
αγγειογενετική CXC χημειοκίνη, μεγέθους 8 kDa, η οποία εκφράζεται ιδιοσύστατα
από κύτταρα στρώματος του μυελού των οστών, αλλά και από πολλά άλλα όργανα
και ιστούς και αποτελεί έναν ισχυρό χημειοτακτικό παράγοντα για τα Τ- και Β-
λεμφοκύτταρα, τα μονοπύρηνα και τα ουδεταρόφιλα. Η δέσμευσή του επί του
υποδοχέα του CXCR4 ενεργοποιεί πολλαπλά μονοπάτια κυτταρικής
σηματοδότησης, τα οποία εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τη
μετανάστευση των κυττάρων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης ότι ο υποδοχέας
του, CXCR4, χρησιμοποιείται από τον ιό της επίκτητης ανοσοσνεπάρκειας τύπου-1
(HIV-1) ως συνυποδοχέας για την είσοδο του στα Τ-λεμφοκΰτταρα.
Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάττη^ξη ενός βακτηριακού
συστήματος για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων ανασυ»*<»οσμένου SDF-1 και
συγκεκριμένα της ισομορφής α της χημειοκίνης (SDF-Ια). Η πιριοχή του cDNA του
SDF-Ια που κωδικοποιεί την ώριμη μορφή της πρωτεΐνης (αα 22-89), δηλαδή
χωρίς το σηματοδοτικό πεπτίδιο, ενισχύθηκε με τη μέθοδο της nested PCR και
κατόπιν κλωνοποιήθηκε με την μέθοδο ΤΑ στον βακτηριακό φορέα pZeTa. Η
μετέπειτα κλωνοποίησή των αλληλουχιών του SDF-Ια στον πλασμιδιακό φορέα
έκφρασης pET21b, οδήγησε στην ενσωμάτωση μιας «ουράς» 6 ιστιδινών (6His)
στο καρβοξυ-τελικό άκρο του SDF-Ια. Στελέχη BL21[DE3] της E.coli
χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε μεγάλα
ποσά. Καθώς διαπιστώθηκε ότι ο SDF-Ια δεν αναδιπλωνόταν σωστά και
συγκεντρωνόταν στα βακτηριακά έγκλειστα, η πρωτεΐνη καθορίσθηκε από αυτά
υπό μετουσιωτικές συνθήκες με χρήση χρωματογραφίας αγχιστείας σε στήλη Νί-
ΝΤΑ-αγαρόζης. Επιπλέον εξετάσθηκαν και οι συνθήκες αναδίπλωσης του καθαρού
SDF-Ια. Τέλος μελετήθηκε και η ικανότητα της χημειοκίνης αυτής να προκαλεί τη
διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος ενός κόνικλου και παρασκευάσθηκαν
πολυκλωνικά αντισώματα ενάντια στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη. | el |