Κλωνοποίηση και έκφραση της ανασυνδυασμένης χημειοκίνης SDF - 1α (Stromal Cell Derived Factor - 1α)

Abstract

Οι χημειοκίνες, μικρές χημειοτακτικές κυτταροκίνες, αποτελούν τους βασικούς ρυθμιστές της μετανάστευσης των κυττάρων. Ο προερχόμενος από κύτταρα του στρώματος παράγοντας-1 (Stromal cell-derived factor-1 / SDF-1), είναι μια αγγειογενετική CXC χημειοκίνη, μεγέθους 8 kDa, η οποία εκφράζεται ιδιοσύστατα από κύτταρα στρώματος του μυελού των οστών, αλλά και από πολλά άλλα όργανα και ιστούς και αποτελεί έναν ισχυρό χημειοτακτικό παράγοντα για τα Τ- και Β- λεμφοκύτταρα, τα μονοπύρηνα και τα ουδεταρόφιλα. Η δέσμευσή του επί του υποδοχέα του CXCR4 ενεργοποιεί πολλαπλά μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης, τα οποία εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τη μετανάστευση των κυττάρων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης ότι ο υποδοχέας του, CXCR4, χρησιμοποιείται από τον ιό της επίκτητης ανοσοσνεπάρκειας τύπου-1 (HIV-1) ως συνυποδοχέας για την είσοδο του στα Τ-λεμφοκΰτταρα. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάττη^ξη ενός βακτηριακού συστήματος για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων ανασυ»*<»οσμένου SDF-1 και συγκεκριμένα της ισομορφής α της χημειοκίνης (SDF-Ια). Η πιριοχή του cDNA του SDF-Ια που κωδικοποιεί την ώριμη μορφή της πρωτεΐνης (αα 22-89), δηλαδή χωρίς το σηματοδοτικό πεπτίδιο, ενισχύθηκε με τη μέθοδο της nested PCR και κατόπιν κλωνοποιήθηκε με την μέθοδο ΤΑ στον βακτηριακό φορέα pZeTa. Η μετέπειτα κλωνοποίησή των αλληλουχιών του SDF-Ια στον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης pET21b, οδήγησε στην ενσωμάτωση μιας «ουράς» 6 ιστιδινών (6His) στο καρβοξυ-τελικό άκρο του SDF-Ια. Στελέχη BL21[DE3] της E.coli χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε μεγάλα ποσά. Καθώς διαπιστώθηκε ότι ο SDF-Ια δεν αναδιπλωνόταν σωστά και συγκεντρωνόταν στα βακτηριακά έγκλειστα, η πρωτεΐνη καθορίσθηκε από αυτά υπό μετουσιωτικές συνθήκες με χρήση χρωματογραφίας αγχιστείας σε στήλη Νί- ΝΤΑ-αγαρόζης. Επιπλέον εξετάσθηκαν και οι συνθήκες αναδίπλωσης του καθαρού SDF-Ια. Τέλος μελετήθηκε και η ικανότητα της χημειοκίνης αυτής να προκαλεί τη διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος ενός κόνικλου και παρασκευάσθηκαν πολυκλωνικά αντισώματα ενάντια στην ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη.