Μελέτη της αλληλεπίδρασης του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α με την περιοχή Myo της πρωτεϊνης που ενεργοποιεί Rho GTPασες, MgcRacGap

Abstract

Ο επαγόμενος από την υποξία μεταγραφικός παράγοντας HIF-1 αποτελεί έναν ετεροδιμερή παράγοντα που αποτελείται από δύο υπομονάδες (α και β) εκ των οποίων η μία (α) ρυθμίζεται από την ενδοκυττάρια συγκέντρωση του οξυγόνου. Ρυθμίζει την έκφραση μιας μεγάλης ομάδας γονιδίων σαν απόκριση στην υποξία, που σχετίζονται με την ερυθροποίηση, την αγγειογένεση, το μεταβολισμό και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αποτελεί πιθανό στόχο αντικαρκινικής θεραπείας, καθώς συχνά αυξάνεται σημαντικά κατά την ογκογένεση και σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορα είδη καρκίνων. Ο HIF-1 αλληλεπιδρά με πληθώρα μορίων, ένα εκ των οποίων είναι και η πρωτεΐνη MgcRacGAP. Ο HIF-1 α συνδέεται άμεσα με την περιοχή Myo της MgcRacGAP. FI MgcRacGAP είναι μια GAP πρωτεΐνη η οποία παίζει ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας των πρωτεϊνών RhoA, Racl και cdc42, συμμετέχοντας έτσι στην οργάνωση του κυτταροσκελετού. Επιπλέον, παίζει σημαντικό ρόλο στην ολοκλήρωση της κυτοκίνησης κατά τη μίτωση. Όταν η MgcRacGAP υπερεκφράζεται σε κύτταρα θηλαστικών, καταστέλλει τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 έως και 80%. Για την καταστολή είναι απαραίτητη η περιοχή Myo, διότι όταν αυτή απαλειφθεί από το μόριο της MgcRacGAP, η καταστολή δεν παρατηρείται πλέον (Lyberopoulou et al. 2007). Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν να εξετασθεί κατά πόσον η περιοχή Myo της MgcRacGAP, αποκομμένη από το υπόλοιπο μόριο, είναι ικανή να καταστείλει τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1. Γΐ αυτό το σκοπό το cDNA που κωδικοποιεί για την περιοχή Myo κλωνοποιήθηκε σε φορείς έκφρασης σε κύτταρα θηλαστικών προκειμένου να παραχθούν οι πρωτεΐνες GFP-Myo και FLAG-Myo και να ελεγχθεί η μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 μετά από επιμόλυνση κυττάρων HeLa και ΗΕΚ293Τ με τα πλασμίδια που παράγουν τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Αποδείχθηκε, με μικροσκοπία φθορισμού για την GFP-Myo και με ανοσοφθορισμό και την μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης για την FLAG-Myo, ότι οι δύο χιμαιρικές πρωτεΐνες δεν είναι δυνατόν να εκφραστούν σε αυτά τα κύτταρα. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ένα ετερόλογο σύστημα όπου ο HIF-1 εκφράζεται, είναι ενεργός και η ενεργότητά του είναι μετρήσιμη σε κύτταρα Saccharomyces cerevisiae (S.c.) (σύστημα YASH) (Braliou et al. 2006). Για το σκοπό αυτό το cDNA της περιοχής Myo κλωνοποιήθηκε σε φορείς έκφρασης σε κύτταρα S.c. προκειμένου να παραχθούν οι πρωτεΐνες GFP-Myo και GST-Myo και να ελεγχθεί η μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 σε κύτταρα S.c. μετασχηματισμένα με τα πλασμίδια που τις εκφράζουν. Πράγματι, τα αποτελέσματα της έκφρασης της πρωτεΐνης GFP-Myo αλλά και της πρωτεΐνης GST-Myo ανεξάρτητα, δείχνουν ότι η περιοχή Myo είναι ικανή να καταστείλει τη μεταγραφική ενεργότητα του HIF-1 κατά τουλάχιστον 50%. Το δεδομένο αυτό υποδεικνύει ότι η άμεση αλληλεπίδραση της περιοχής Myo της MgcRacGAP με την υπομονάδα HIF-Ια είναι υπεύθυνη για την μείωση της μεταγραφικής ενεργότητας του HIF-1.