Ανίχνευση της ΔF508 μετάλλαξης του γονιδίου CFTR σε ασθενείς με κυστική ίνωση

Abstract

Η Κυστική Ίνωση (ΚΙ) αποτελεί μια από τις πιο συχνές κληρονομικές νόσους της Καυκάσιας φυλής καθώς και μια από τις πιο κοινές αιτίες θανάτου στην παιδική ηλικία. Πρόκειται για ένα πολυσυστηματικό νόσημα, το οποίο φαινοτυπικά χαρακτηρίζεται από δυσλειτουργία των εξωκρινών αδένων με κύριες κλινικές εκδηλώσεις από το αναπνευστικό, το πεπτικό και το γεννητικό σύστημα καθώς και τους ιδρωτοποιούς αδένες. Οι κύριες αυτές εκδηλώσεις οφείλονται σε διαταραχή της διαμεμβρανικής διακίνησης ιόντων Να+ και CT, με αποτέλεσμα τη δημιουργία παχύρρευστης βλέννης, η οποία οδηγεί σε αποφρακτική πνευμονοπάθεια και δυσλειτουργία του παγκρέατος και των ιδρωτοποιών αδένων. Η νόσος είναι αμιγώς γενετική μονογονιδιακή, μεταβιβάζεται κατά τον υποτελή αυτοσωμικό χαρακτήρα και προσβάλλει περίπου 1 στα 2.500 νεογέννητα. Εμφανίζει γενοτυπική ετερογένεια, καθώς έχουν εντοπισθεί μέχρι σήμερα περισσότερες από 800 μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικεύει την προκεΐνη CFTR. Η AF508 μετάλλαξη, η οποία έχει βρεθεί περίπου στο 70% των χρωμοσωμάτων σε ασθενείς με ΚΙ στον Καυκάσιο πληθυσμό, αποτελεί την πιο συχνή μετάλλαξη που προκαλεί την ασθένεια. Σκοπός της παρούσας πτυχιακής εργασίας είναι η ανάπτυξη μεθοδολογίας, στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, για την ανίχνευση της AF508 μετάλλαξης σε δείγματα ανθρώπινου DNA. Για το σκοπό αυτό πολλαπλασιάστηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και κατάλληλους εκκινητές αλληλουχία 98bp στο εξόνιο 10 του γονιδίου CFTR. Παρουσία της μετάλλαξης AF508 λαμβάνεται προϊόν κατά 3bp μικρότερο στο μεταλλαγμένο αλλήλιο σε σχέση με το φυσιολογικό. Τα δύο προϊόντα PCR μπορούν να διαχωριστούν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης (PAGE), μια απλοποιημένη, χαμηλού κόστους και ταχεία διαγνωστική τεχνική. Ομοζυγώτης της AF508 μετάλλαξης εμφανίζει ζώνη μεγαλύτερης κινητικότητας από τη ζώνη του ομοζυγώτη φυσιολογικού, ενώ ο ετεροζυγώτης εμφανίζει τέσσερις ζώνες, δύο που αντιστοιχούν στο μεταλλαγμένο και στο φυσιολογικό αλλήλιο, καθώς και δύο που οφείλονται στη δημιουργία ετεροδιμερών σχηματισμών μεταξύ των δύο αλληλίων. Η μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς σε 17 δείγματα DNA φυσιολογικών, ομοζυγωτών και ετεροζυγωτών της AF508 μετάλλαξης. Η μελέτη αυτή ελπίζουμε να συνεχιστεί σε μεγαλύτερο δείγμα ατόμων της περιφέρειας Θεσσαλίας για να διερευνηθεί η συχνότητα αυτής της μετάλλαξης σ αυτό τον πληθυσμό.