Nested multiplex PCR για τον γονοτυπικό προσδιορισμό των 14 πιο επικίνδυνων HPV ιών

Abstract

Οι ιοί των θηλωμάτων (papillomaviruses) ανακαλύφθηκαν στις αρχές του 20 αιώνα από τον Francis Peyton Rous και ανήκουν στην οικογένεια των papillomaviridae. Είναι δίκλωνοι κυκλικοί επιθήλιο-πολλαπλασιαζόμενοι ιοί και ευθύνονται για την πρόκληση θηλωμάτων, που μπορούν να εξελιχθούν σε κακοήθη όγκο. Μολύνουν μια ευρεία κλίμακα οργανισμών, η οποία εκτείνεται από τα πτηνά μέχρι τα θαλάσσια θηλαστικά. Ο ιός των θηλωμάτων απέκτησε μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον όταν διαπιστώθηκε ότι προκαλεί μια σειρά δερματικών αλλοιώσεων στον άνθρωπο. Ο Ιός των Ανθρωπίνων Θηλωμάτων (HPV) μεταδίδεται μέσω δερματικής επαφής και είναι υπεύθυνος για την πρόκληση ποικίλων ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων. Οι περισσότερες HPV λοιμώξεις είναι ασυμπτωτικές. Έχουν πλήρως αναγνωριστεί περισσότεροι από 130 τύποι του ιού, ορισμένοι από τους οποίους ευθύνονται για την πρόκληση δερματικών κονδυλωμάτων, κυρίως των παλαμών και των πελμάτων. Το ένα τρίτο των τύπων του ιού μεταδίδεται μέσω σεξουαλικής επαφής και αναπτύσσεται στη γεννητική περιοχή των ατόμων. Επιδημιολογικές και πειραματικές μελέτες έχουν αποδείξει σαφώς ότι διάφοροι τύποι των HPV ( HPV-υψηλού κινδύνου) αποτελούν βασική αιτία πρόκλησης καρκίνου στον τράχηλο της μήτρας, ενώ ορισμένοι άλλοι τύποι HPV (HPV- χαμηλού κινδύνου) προκαλούν κοινά κονδυλώματα του γενετικού συστήματος. Παρά το γεγονός ότι η εφαρμογή των προληπτικών κυτταρολογικών εξετάσεων (test pap) ελάττωσε την εμφάνιση της νόσου στις Δυτικές χώρες, τα ποσοστά παραμένουν αρκετά υψηλά. Για τον λόγω αυτό η ανίχνευση και ταυτοποίηση των HPV έχει μεγάλη ερευνητική σημασία για την έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση της μόλυνσης. Η ετερογένεια του φάσματος των HPV και η σημαντική επίπτωση των πολλαπλών μολύνσεων στην ανάπτυξη καρκίνου κάνει απαραίτητη την ανάπτυξη αξιόπιστων μεθόδων για την αναγνώριση των ποικίλων HPV γονοτύπων , όχι μόνο για επιδημιολογικές μελέτες αλλά και για την θεραπεία των ασθενών. Για τον σκοπό αυτό εργαστήρια παγκοσμίως ασχολούνται με την ανάπτυξη νέων μεθόδων ή για την βελτίωση των ήδη υπαρχόντων, έτσι ώστε να είναι δυνατή η ανίχνευση του ιού πριν ακόμα εκδηλωθούν τα κλινικά συμπτώματα (κονδυλώματα-καρκίνος). Μια σημαντική μέθοδος με εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία για την άμεση ανίχνευση και ταυτοποίηση του ιού είναι η Nested Multiplex PCR, με την οποία ασχολείται η συγκεκριμένη αυτή εργασία. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η εφαρμογή της Nested Multiplex PCR για τον γονοτυπικό προσδιορισμό των 14 πιο ετακίνδυνων HPV (High risk) (6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45,51,52,58,59, 66, 68). Για την διαδικασία αυτή χρησιμοποιήθηκαν και εξετάστηκαν συνολικά 71 κλινικά δείγματα από το αντικαρκινικό νοσοκομείο Αθηνών ʼγιος Σάββας. Για την επίτευξη της μεθόδου αυτής χρησιμοποιήθηκαν σε ένα πρώτο επίπεδο οι GP- Ε6/Ε7 εκινητές (degenerate primers), με τους οποίους ενισχύθηκε με μια πρώτη PCR το ιικό DNA στην περιοχή των γονιδίων Ε6 και Ε7 όλων των HPV γονοτύπων υψηλής επικινδυνότητας. Στην συνέχεια με την χρήση τύπο-ειδικών Nested PCR εκινητών, πραγματοποιήθηκε Nested Multiplex PCR για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των 14 HPV ιών που μελετήθηκαν σε αυτή την εργασία.