Μελέτη των μοριακών μηχανισμών απόκρισης στην υποξία : έκφραση και απομόνωση του ανασυνδυασμένου HIF-la

Abstract

Ο HIF-la είναι ένα πολυπεπτίδιο, που αποτελείται από 826 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος, περίπου, 93kD. Ο HIF-la επίσης, αποτελεί τη μία από τις δύο υπομονάδες- η άλλη είναι ο HIF-1 β - που συναποτελούν το μεταγραφικό παράγοντα HIF-1, ο οποίος, ρυθμίζει την κυτταρική απόκριση στην υποξία. Στην παρούσα πειραματική εργασία, εκφράσαμε τον HIF-la σε βακτήρια, Escherichia Coli και πιο συγκεκριμένα στο κυτταρικό στέλεχος (strain) BLR/Rep4. Ως όχημα μεταφοράς και έκφρασης στα κύτταρα αυτά χρησιμοποιήσαμε τα πλασμίδια pQE60 και pQE60-protA (zzpQE60). Η έκφραση στα πλασμίδια αυτά μας εξασφάλισε μια ακολουθία έξι ιστιδινών στο καρβοξυτελικό άκρο των ανασυνδυασμένων χιμαιρικών πρωτεϊνών, που κατασκευάσαμε. Επιπλέον, η πρωτεΐνη, που εκφράστηκε στο zzpQE60, περιείχε και την περιοχή της πρωτεΐνης A του Staphyloccocus aureus, η οποία και προσδένεται με την CL περιοχή των IgG αντισωμάτων, στο αμινοτελικό της άκρο, για την ανοσοενζυμική της ανίχνευση. Για την έκφραση του HIF-la κατασκευάστηκαν δύο ανασυνδυασμένα πλασμίδια με το cDNA του γονιδίου του (insert) χρησιμοποιώντας το pQE60 και δύο με το zzpQE60. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν και δύο κατασκευές, όπου το zzpQE60 είχε ανασυνδυαστεί με το cDNA της snpl και snpl-26-353 (δύο μορφές της snourportin-1, εκ των οποίων η snourportin-1-26-353 έχει μια απαλοιφή των 26 πρώτων αμινοξέων ), για να έχουμε έναν πιλότο στα πειράματα επαγωγής της έκφρασης και καθαρισμού των HIF-la και protA- HIF-la. Μετά το μετασχηματισμό των κυττάρων BLR/REp4 και την καλλιέργεια τους ακολούθησε η επαγωγή της έκφρασης των πρωτεϊνών με ισοπρόπυλο- θειογαλακτοπυρανοσίδιο (IPTG), και ο καθαρισμός τους σε στήλες Νί-ΝΤΑ-αγαρόζη. Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμίδης και η ανίχνευση των ζωνών έγινε με τη χρώση Coomassie blue, με ECL και με χρωματική αντίδραση. Παρατηρήσαμε ότι τόσο ο HIF-la όσο και ο HIF-la-protA, εκφράστηκαν στα E.Coli αλλά σε μικρότερες ποσότητες σε σχέση με τη snurportin. Σε ότι δε αφορά τον καθαρισμό αυτών, ο HIF-la-protA, αποδείχτηκε πιο διαλυτός από τον HIF-la και ανακτήθηκε έστω και σε μικρή ποσότητα από τη στήλη καθαρισμού και μάλιστα καθαρή από προσμίξεις. Ο HIF-la παρέμεινε στο ίζημα και κάποια μόνο πρωτεολύματα του ανιχνεύτηκαν στα κλάσματα μετά την ανάκτηση της στήλης. Οι δύο, τέλος, μορφές των snurportins καθαρίστηκαν με επιτυχία και χωρίς προσμίξεις στα κλάσματα ανάκτησης της στήλης.