Μελέτη των χαρακτηριστικών της in vitro αναστολής της δράσης της κινάσης SRPK1a από τον παράγοντα της πυρηνικής μήτρας SAFB

Abstract

Η SRPKla (SR Protein kinase la) αποτελεί μια ισομορφή της SRPK1, δηλαδή είναι μια κινάση σερίνης αργινίνης, η οποία φωσφορυλιώνει επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες διπεπτιδίων RS. Τα πιο γνωστά υποστρώματα της SRPKla είναι οι SR πρωτεΐνες, ο υποδοχέας της λαμίνης LBR (Lamin Β Receptor) και η πρωταμίνη Ρ1, εμπλέκοντας την κινάση αυτή στην διαδικασία του ματίσματος, αλλά και στην οργάνωση της χρωματίνης. Οι SAFB1 και SAFB2 (Scaffold Attachment Factor 1,2) είναι δυο πρωτεΐνες που ανήκουν στην ίδια οικογένεια και παρουσιάζουν 74% ομολογία στις αμινοξικές τους αλληλουχίες.Ο SAFB1 είναι μια πρωτεΐνη της πυρηνικής μήτρας, η οποία έχει εμπλακεί σε πολλές κυτταρικές διαδικασίες (μεταγραφή, διαμόρφωση χρωματίνης, μάτισμα), ενώ για τον SAFB2 λίγα είναι γνωστά. Με το σύστημα των δύο υβριδίων βρέθηκε ότι το καρβοξυτελικό άκρο του SAFB1 αλληλεπιδρά με το αμινοτελικό άκρο της SRPKla, κάτι το οποίο δεν συμβαίνει με την SRPK1 (έχει βρεθεί ελάχιστη αλληλεπίδραση μεταξύ των δυο αυτών μορίων). Επιπλέον, σε in vitro δοκιμασίες δράσης κινάσης βρέθηκε ότι η δράση της κινάσης SRPKla αναστέλλεται παρουσία του παράγοντα αυτού όταν σαν υπόστρωμα χρησιμοποιείται ο LBR. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε μια προσπάθεια να ανιχνευθεί η αιτία αυτής της αναστολής. Δεδομένου ότι το καρβοξυτελικό άκρο του SAFB1 είναι πλούσιο σε διπεπτίδια RE, τα οποία προσομοιάζουν χημικά τις αλληλουχίες RS που είναι φυσικά υποστρώματα των κινασών SRPK υποθέσαμε ότι μπορεί η RE περιοχή να είναι υπεύθυνη γι' αυτή την αναστολή. Για το λόγο αυτό δημιουργήθηκε μια πλασμιδιακή κατασκευή από την οποία παράχθηκε μια πρωτεΐνη, η οποία αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο του SAFB1 απαλλαγμένο από την πλούσια σε RE περιοχή του. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της πρωτεΐνης αυτής στην δράση της κινάσης και αποδείχθηκε ότι αυτή δεν είναι ικανή να αναστείλει την φωσφορυλίωση, σε αντίθεση με το καρβοξυτελικό άκρο του SAFB1 το οποίο διαθέτει τα RE. Βάσει αυτού του αποτελέσματος επαληθεύσαμε την αρχική μας υπόθεση ότι τα RE είναι υπεύθυνα για την αναστολή της δράσης της κινάσης. Επιπλέον, τέθηκε το ερώτημα εάν η αντίστοιχη περιοχή του παράγοντα SAFB2 είναι ικανή να αναστείλει την δράση της κινάσης, δεδομένου ότι το καρβοξυτελικό του άκρο διαθέτει μια περιοχή πλούσια σε RE και ότι ομοιάζει σε ποσοστό 63% με αυτό του SAFB1. Γι' αυτό το λόγο δημιουργήθηκε μια πλασμιδιακή κατασκευή ικανή να παράγει την πρωτεΐνη SAFB2 με αλληλουχία αντίστοιχη με αυτή του καρβοξυτελικού άκρου του SAFB1, ώστε οι δύο πρωτεΐνες να είναι ομοίου μεγέθους. Η πρωτεΐνη αυτή εκφράστηκε με επιτυχία και θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά σε πειράματα ελέγχου της δράσης της SRJPKla.