Κλωνοποίηση, έκφραση και απομόνωση της αμινοακυλο-tRNA συνθετάσης της μεθειονίνης από το βακτήριο Deinococcus radiodurans και του παράγοντα επιμηκυνσής του από τα βακτήρια Thermus thermophilus και Escherichia coli

Abstract

Η αμινοάκυλο-συνθετάση της μεθειονίνης (MetRS) είναι μέλος της οικογένειας των 20 AARSs που είναι απαραίτητες για την πρωτεϊνοσύνθεση και τη διατήρηση της πιστότητάς της. Ανήκει στην τάξη I και αναγνωρίζει το εναρκτήριο tRNA καθώς και το tRNAMet. Η ανάλυση των κρυσταλλικών δομών από διάφορες MetRSs έχει δώσει ενδιαφέρουσες πληροφορίες για την αρχιτεκτονική του ενζύμου και την αμινοακυλίωση. Ένα από τα ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά της MetRS είναι η δομική της ποικιλομορφία, καθώς πολυάριθμες βιοχημικές και γενετικές μελέτες έχουν αποκαλύψει την παρουσία επιπλέον περιοχών προσαρτημένων στον καταλυτικό πυρήνα του ενζύμου. Αυτές οι περιοχές είναι υπεύθυνες για την αλληλεπίδραση του ενζύμου με το tRNA και με άλλες πρωτεΐνες σχηματίζοντας σύμπλοκα. Η MetRS παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι εμπλέκεται και σε άλλες κυτταρικές διεργασίες όπως στη διατήρηση της μεταφραστικής πιστότητας και στη βιογένεση του ριβοσώματος. Εξέχουσας σημασίας είναι και η πρόσδεση του σωστού aa-tRNA στο ριβόσωμα, μια διαδικασία που καταλύεται από τον παράγοντα επιμήκυνσης της πρωτεϊνοσύνθεσης EF-Tu. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας κλωνοποιήθηκε το γονίδιο της MetRS (metG) από το βακτήριο Deinococcus radiodurans και ακολούθησε η υπερέκφραση και απομόνωση της συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας κλωνοποιήθηκαν τα γονίδια tufl και tiifA του παράγοντα EF-Tu από τα βακτήρια Thermus thermophilus και Escherichia coli, αντιστοίχως, και ακολούθησε έκφραση και καθαρισμός των πρωτεϊνών.