Κλωνοποίηση, υπερέκφραση και απομόνωση της Glu-Αμιδοτρανσφεράσης GATDE από το αρχαίο Pyrococcus abyssi

Abstract

Ένα πεδίο στο οποίο η σύγκριση μεταξύ των τριών βασιλείων των οργανισμών, αρχαία, βακτήρια και ευκαρυώτες, είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα είναι οι μηχανισμοί της αμινοακυλίωσης των tRNAs. Η αμινοακυλίωση αποτελεί μια σημαντική κυτταρική διαδικασία κατά την οποία, φυσιολογικά, πραγματοποιείται η σύνθεση των αμινοάκυλο-tRNAs από τα ένζυμα αμινοάκυλο-tRNA σύνθετάσες (AARSs). Ωστόσο, πολυάριθμες μελέτες έχουν αποκαλύψει μεγάλη διαφοροποίηση και ποικιλομορφία όσον αφορά τους μηχανισμούς αμινοακυλίωσης ανάμεσα στους διαφορετικούς οργανισμούς. Παράδειγμα αποτελεί η ύπαρξη έμμεσων μονοπατιών αμινοακυλίωσης σε ορισμένους οργανισμούς, τα οποία διεξάγονται με τη βοήθεια των ενζύμων tRNA-εξαρτώμενων αμιδοτρανσφερασών (AdTs). Η αμιδοτρανσφεράση που συναντάται σε αρκετά βακτήρια και αρχαία, είναι η GatCAB, η οποία είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση Asn-tRNAAsn και Gln-tRNAGhl. Επίσης, έχει επιβεβαιωθεί η ύπαρξη μιας δεύτερης αμιδοτρανσφεράσης η οποία εντοπίζεται αποκλειστικά στα αρχαία και εμπλέκεται στη σύνθεση Gln-tRNAGln, η λεγάμενη GatDE. Έχει παρατηρηθεί μεγάλο ποσοστό ομοιότητας της αλληλουχίας και της λειτουργίας ανάμεσα στις υπομονάδες των δύο αμιδοτρανσφερασών. Επομένως, είναι εύλογη η υπόθεση ότι η μελέτη του ενός ενζύμου μπορεί να παρέχει χρήσιμες πληροφορίες και για το άλλο. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η κλωνοποίηση των δύο γονιδίων της GatDE και η δημιουργία ενός οπερονίου, το οποίο αποτελείται από τα δύο επιμέρους γονίδια. Ακολούθησε η μεταφορά του οπερονίου σε στελέχη Ε. coli, ενώ επιπλέον, διεξήχθει υπερέκφραση και απομόνωση ολόκληρου του ενζύμου GatDE.