Μελέτη της παθογένειας, ευπάθειας και παθολογίας του ιού NODA σε ευρύαλα είδη ψαριών εκτρεφόμενα υπό διαφορετικές συνθήκες αλατότητας

Abstract

Οι Noda-ioi που προσβάλλουν τα ψάρια (κλάση οστεοϊχθείς) ανήκουν στην οικογένεια Nodaviridae και στο γένος Betanodavirus (Carstens και συν., 2000). Η περιγραφή της μορφολογίας του πρώτου Betanoda-ιού που απομονώθηκε από ψάρια και η ταυτοποίησή του ως αιτιολογικού παράγοντα της νόσου της ιογενούς εγκεφαλοπάθειας και αμφιβληστροειδοπάθειας (VER) έγινε από τους Yoshikoshi & Inoue (1990). Το σωματίδιο των Betanoda-ιών είναι σφαιρικό, με διάμετρο 25-34 nm και αποτελείται από το καψίδιο και το γένωμα. Οι Noda-ioi των ψαριών έχουν κατηγοριοποιηθεί σε τέσσερις γενότυπους, σύμφωνα με φυλογενετική ανάλυση που βασίστηκε στην αλληλουχία των νουκλεοτιδίων της μεταβλητής περιοχής (Τ4 περιοχή) του RNA2 γενωμικού τμήματος. Στα ψάρια της Μεσογείου έχουν απομονωθεί μέχρι σήμερα δύο από τους γενότυπους αυτούς, ο RGNNV και ο BFNNV (Thiery και συν., 2004) με πιο συχνό τον πρώτο. Η ιογενής εγκεφαλοπάθεια και αμφιβληστροειδοπάθεια είναι μία σημαντική νόσος των λαρβών, αλλά και ψαριών μεγαλύτερου μεγέθους. Τα περισσότερα ψάρια προσβάλλονται στο στάδιο της προνύμφης ή σε νεαρά στάδια ανάπτυξης, οπότε οι απώλειες είναι συνήθως πολύ μεγάλες. Γενικά, τα κλινικά συμπτώματα συσχετίζονται με τις αλλοιώσεις στον εγκέφαλο και τον αμφιβληστροειδή, δηλαδή παρατηρούνται κινητικές ανωμαλίες, απώλεια ελέγχου της νηκτικής κύστης, δυσκολία στην όραση και σκούρος χρωματισμός του δέρματος. Η νόσος παρατηρήθηκε για πρώτη φορά στην Ελλάδα στις αρχές του Ιουλίου του 1995 (Le Breton και συν., 1997) στο λαβράκι. Έκτοτε έχει αναφερθεί και από άλλους έλληνες ερευνητές αφού αποτελεί μια σημαντική νόσο που προκαλεί κάθε χρόνο μεγάλες απώλειες στις ελληνικές ιχθυοκαλλιέργειες. Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη μελέτη της παθογένειας, της ευπάθειας και της παθολογίας του Noda-ιού σε ευρύαλα είδη ψαριών εκτρεφόμενα υπό διαφορετικές συνθήκες αλατότητας. Η διατριβή χωρίζεται σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος περιέχει τη βιβλιογραφική ανασκόπηση και το δεύτερο μέρος αφορά στη δική μας έρευνα και απαρτίζεται από τρία κεφάλαια τα: "Υλικά και Μέθοδοι”, "Αποτελέσματα” και "Συζήτηση”. Στο πρώτο μέρος γίνεται ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας και διαιρείται σε τρία κεφάλαια. Στο πρώτο κεφάλαιο περιγράφεται η κατάσταση των υδατοκαλλιεργειών σε παγκόσμιο, ευρωπαϊκό και ελληνικό επίπεδο. Στο δεύτερο περιγράφεται η ταξινόμηση, η μορφολογία, η δομή και η σύσταση του ιού καθώς και οι φυσικοχημικές ιδιότητές του, η φυλογενετική συγγένεια μεταξύ των ειδών της οικογένειας Nodavirinae και η ορολογική συγγένεια των γενοτύπων των Betanoda- ιών. Στο τρίτο κεφάλαιο γίνεται βιβλιογραφική ανασκόπηση της νόσου της ιογενούς εγκεφαλοπάθειας και αμφιβληστροειδοπάθειας. Ειδικότερα περιγράφεται η παθογένεια της νόσου, τα κλινικά συμπτώματα, οι παθολογοανατομικές αλλοιώσεις που παρατηρούνται, η επιζωοτιολογία, οι τρόποι διάγνωσης και πρόληψης του ιού και τέλος περιγράφονται οι μέθοδοι πειραματικής μόλυνσης ψαριών με Noda-ιούς που υπάρχουν μέχρι σήμερα στη διεθνή βιβλιογραφία. Στο δεύτερο μέρος στο κεφάλαιο "Υλικά και Μέθοδοι”, περιγράφεται το πειραματικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση ενός προκαταρκτικού και δύο κυρίως πειραμάτων, τα υλικά και οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν για την ανίχνευση του ιού και τα στατιστικά πακέτα που χρησιμοποιήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Στο κεφάλαιο "Αποτελέσματα” περιγράφονται τα ευρήματα της κλινικής εξέτασης των ψαριών των δύο πειραμάτων κατά την οποία στο πρώτο πείραμα διαπιστώθηκε ότι τα λαβράκια που εκτρέφονταν σε γλυκό νερό εκδήλωσαν πιο έντονα συμπτώματα και υψηλότερο ποσοστό θνησιμότητας, σε σχέση με τα λαβράκια που εκτρέφονταν σε ενυδρεία με νερό ενδιάμεσης ή πλήρους αλατότητας. Επίσης παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time PCR), με την οποία έγινε η τιτλοποίηση του ιού στους οφθαλμούς των ψαριών όλων των ενυδρείων, καθώς και η συσχέτιση των τίτλων του ιού με τις ημέρες μετά από τον ενοφθαλμισμό των ψαριών. Ακόμα, αναφέρονται τα αποτελέσματα της απομόνωσης του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες κατά την οποία διαπιστώθηκε ότι δείγματα αρνητικά με τη μέθοδο αυτή, ήταν θετικά όταν ελέγχθηκαν με τη μέθοδο της real-time PCR. Επιπλέον περιγράφεται η ανάλυση πρωτοδιάταξης των γενωμάτων του ιού που απομονώθηκαν από τους οφθαλμούς των ψαριών και τέλος, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της ιστοπαθολογικής μελέτης του πρώτου και δευτέρου πειράματος σε συνάρτηση με τις ημέρες μετά την έναρξη των πειραμάτων. Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής συνοψίζονται στα εξής: • Παρό,τι τα λαβράκια στο ενυδρείο του γλυκού νερού είχαν μικρότερους τίτλους ιού από τα λαβράκια στα ενυδρεία με ενδιάμεση ή πλήρη αλατότητα, οι θνησιμότητες στα ψάρια αυτά ήταν μεγαλύτερες. • Το μεγαλύτερο ποσοστό θνησιμότητας που παρατηρήθηκε στα λαβράκια του γλυκού νερού είναι πιθανό να οφείλεται στην μειωμένη ικανότητα του ανοσοποιητικού συστήματος των ψαριών αυτών να αντιμετωπίσει τον ιό. Η διαταραχή αυτή προκλήθηκε από το οσμωτικό στρες στο οποίο υποβάλλονται τα ψάρια όταν μεταφέρονται στο γλυκό νερό. • Η προσβολή του ΚΝΣ και ιδιαίτερα της υπόφυσης από τον ίδιο τον ιό, είναι πιθανό να οδήγησε στη διαταραχή της ομοιοστασίας του οργανισμού των ψαριών σε επίπεδο ορμονών. Αποτέλεσμα της ορμονικής διαταραχής ήταν η πρόκληση προβλημάτων στην οσμωρύθμιση των ψαριών. Τα ψάρια αυτά ήταν πιο επιρρεπή σε οποιαδήποτε παθολογική κατάσταση και κατ' επέκταση στη μόλυνση από το Noda-ιό. Πρέπει να δοθεί μεγάλη σημασία στην αποφυγή των στρεσσικών καταστάσεων σε διαχειριστικό επίπεδο στις μονάδες διότι η σημασία της πρόκλησης στρες κατά τη διάρκεια της μόλυνσης με τον Noda- ιό αποδείχθηκε κατά την παρούσα διατριβή. • Η μέθοδος της real-time PCR είναι μια πολύ αξιόπιστη και ευαίσθητη μέθοδος με την οποία επιτυγχάνεται ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός του ιού στους ιστούς των ψαριών. Δίνει τη δυνατότητα να συσχετισθούν τα συμπτώματα, η παθολογοανατομική εικόνα και οι θνησιμότητες στα ψάρια με την εξέλιξη των τίτλων του ιού κατά τη διάρκεια της νόσου, σε συντομότερο χρονικό διάστημα απ' ότι η κλασική μέθοδος απομόνωσης του ιού σε κυτταροκαλλιέργειες. • Στα λαβράκια του πρώτου πειράματος παρατηρήθηκε αντιστοιχία μεταξύ της ημέρας που παρατηρήθηκαν οι υψηλότεροι τίτλοι του ιού στους ιστούς τους και της ημέρας που παρατηρήθηκε το μεγαλύτερο ποσοστό συμπτωμάτων. • Οι τσιπούρες στο πρώτο πείραμα δεν εκδήλωσαν συμπτώματα μετά από μόλυνση με δύο διαφορετικές δόσεις του ιού. • Η μόλυνση επιβεβαιώθηκε με τη μέθοδο της real-time PCR και οι τίτλοι του ιού στους οφθαλμούς τους ήταν μικρότεροι από εκείνους του λαβρακιού παρό,τι η μολύνουσα δόση στις τσιπούρες ήταν ίδια και μεγαλύτερη από αυτή στα λαβράκια. • Οι τίτλοι του ιού στις τσιπούρες είχαν την ίδια εξέλιξη από απόψεως χρόνου όπως και εκείνοι των λαβρακιών. • Ο ιός μεταδόθηκε σε υγιή λαβράκια μετά από βρώση οφθαλμών των ασυμπτωματικά μολυσμένων τσιπούρων του πρώτου πειράματος.