Οι δύο ισομορφές της ελαφριάς αλυσίδας 2 (MLC2) της μυοσίνης : εναλλακτική πολυαδενυλίωση και ιστική κατανομή

Abstract

Η μυοσίνη, η κυριότερη πρωτεΐνη συστολής των παχιών νηματίων, αποτελείται από έξι πολυπεπτιδικές αλυσίδες: δύο όμοιες βαριές αλυσίδες και τέσσερις ελαφριές αλυσίδες (MLCs: Myosin light chains), δύο ρυθμιστικές ελαφριές αλυσίδες (MLC2) και δύο αλκαλικές ελαφριές αλυσίδες (MLC1, MLC3). Η MLC2 αναφέρεται ως ρυθμιστική καθώς έχει ρυθμιστικό, αν όχι καταλυτικό ρόλο, στη δέσμευση του ασβεστίου (Ca2+). Η παρούσα εργασία παρουσιάζει την απομόνωση, το χαρακτηρισμό, την ιστική κατανομή, αλλά και τη μοριακή εξέλιξη της ισομορφής Β της MLC2 της τσιπούρας, η οποία εκφράζεται έντονα στο σκελετικό μυ, ασθενέστερα στον καρδιακό και λείο μυ αλλά και σε μη μυϊκούς ιστούς. Επιπλέον, παρουσιάζει την απομόνωση τριών εναλλακτικών μεταγράφων της ήδη γνωστής ισομορφής Α της MLC2 που εκφράζεται αποκλειστικά στο σκελετικό μυ (κόκκινο και λευκό μυ). Διαφορετικά μετάγραφα της ισομορφής Α της MLC2 και η ισομορφή Β της MLC2 απομονώθηκαν από cDNA βιβλιοθήκη κατασκευασμένη από εμβρυϊκά στάδια τσιπούρας στη διάρκεια ενός EST project. Για κάθε ένα από τους κλώνους της MLC2 πραγματοποιήθηκε πλήρης αλληλούχιση πέντε φορές, η οποία ανέδειξε την παρουσία τριών διαφορετικών μεταγράφων της ήδη γνωστής ισομορφής Α της MLC2 (accession number AF150904), αλλά και μία νέα ισομορφή. Οι δύο ισομορφές της MLC2 της τσιπούρας έχουν το ίδιο μήκος (170aa), αλλά διαφέρουν ως προς δέκα αμινοξέα, όλα εκτός της περιοχής δέσμευσης ασβεστίου. Αυτά τα 10 αμινοξέα είναι κοινά ανάμεσα στις ισομορφές Β του ιππόγλωσσου και της τσιπούρας και πιθανόν να αποτελούν χαρακτηριστικά των ισομορφών Β της MLC2. Η κατανομή των δύο ισομορφών στους ιστούς: κόκκινος μυς, λευκός μυς, στομάχι, πυλωρικά τυφλά, πρόσθιο έντερο, οπίσθιο έντερο, νεφρός, ήπαρ, εγκέφαλος, βράγχια, καρδιά, επιδερμίδα, και σπλήνας, εξετάσθηκε με τη μέθοδο της RT-PCR και εκκινητές εξειδικευμένους για κάθε ισομορφή. Μετάγραφα της MLC2 ήταν παρόντα σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν. Η ισομορφή Α της MLC2 της τσιπούρας εκφράζεται μόνο στο σκελετικό μυ (ερυθρό και λευκό μυ). Η ισομορφή Β εκφράζεται έντονα στο σκελετικό μυ (ερυθρό και λευκό μυ) , αλλά είναι παρούσα στο λείο και καρδιακό μυ και στους μη μυϊκούς ιστούς που εξετάστηκαν. Πιθανόν, οι δύο ισομορφές να είναι εναλλακτικά μετάγραφα του ιδίου γονιδίου, οπότε η εναλλακτική μεταγραφή των εξωνίων τους ρυθμίζεται ρυθμίζεται ιστικά ή αναπτυξιακά. Εξίσου πιθανό είναι να υπάρχει διαφορά στις ιδιότητες συστολής των μορίων μυοσίνης που συμμετέχουν. Ένα επιπλέον στοιχείο για την ήδη γνωστή ισομορφή Α της MLC2 της τσιπούρας ήταν η απομόνωση τριών μεταγράφων, τα οποία ενώ προέρχονται από το ίδιο γονίδιο και φέρουν παρόμοιο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης, διαφέρουν αποκλειστικά και μόνο στο μήκος της 3 αμετάφραστης περιοχής τους. Τα εναλλακτικά μετάγραφα προκύπτουν από την εναλλακτική χρήση των τριών διαφορετικών σημάτων πολυαδενυλίωσης, τα οποία εντοπίζονται στη 3 -UTR της αλληλουχίας της ισομορφής Α. Η εναλλακτική πολυαδενυλίωση είναι μια μετα- μεταγραφική διαδικασία, η οποία παράγει μετάγραφα με διαφορετική σταθερότητα και μεταφραστική αποτελεσματικότητα. Τέλος, για να διευκρινιστούν οι εξελικτικές σχέσεις ανάμεσα στις ισομορφές Α και Β της MLC2 της τσιπούρας (Sparus aurata) και στις MLC2 άλλων τελεόστεων ιχθύων πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση των αμινοξικών αλληλουχιών αλληλουχιών των MLCs2. Οι αλληλουχίες των MLC2 των διαφόρων ιχθύων που χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση με τις αλληλουχίες των δύο ισομορφών της MLC2 της τσιπούρας και την κατασκευή του φυλογενετικού δένδρου ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων GenBank. Οι εξελικτικές αποστάσεις υπολογίστηκαν με χρήση της εμπειρικής μεθόδου του Kimura για τις πρωτεΐνες και το δένδρο κατασκευάστηκε με τη μέθοδο neighbour-joining. Για τη φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν 100 bootstrap αναλύσεις. Από την κατάταξη των MLC2 πρωτεϊνών των ιχθύων στο δενδρόγραμμα προκύπτουν τρεις ανεξάρτητες ομάδες υποομάδες και οι ισομορφές Α και Β της MLC2 της τσιπούρας ομαδοποιούνται με τις αντίστοιχες ισομορφές της MLC2 του ιχθύος ιππόγλωσσος (Hippoglossus hippoglossus).