Μοριακή ανάλυση τοπικών ποικιλιών φασολιού με δείκτες RAPD και παρασκευή αντισώματος για την πρωτεΐνη PvLHY που ελέγχει τον φωτοπεριοδισμό

Abstract

Κατά την εκπόνηση της παρούσας διατριβής έγινε μια προετοιμασία με σκοπό τη παραγωγή πολυκλιονικών αντισωμάτων έναντι της πρωτεΐνης PvLHY που κατέχει πρωταγωνιστικό ρόλο στη κιρκαδική ρύθμιση του είδους Phaseolus vulgaris. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκαν δεκαπέντε ημικυρίαρχοι μοριακοί δείκτες τύπου RAPD για τη φυλογενετική ανάλυση των γενοτύπων που αντιπροσωπεύουν δέκα τοπικούς πληθυσμούς του αυτογονιμοποιούμενου είδους Phaseolus vulgaris και ενός που ανήκει στο σταυρογονιμοποιούμενο είδος Phaseolus coccineus. Τα αποτελέσματα της μοριακής φυλογενετικής ανάλυσης συγκρίθηκαν με τα εκείνα που προέκυψαν από την ομαδοποίηση των ίδιων γενοτύπων με βάση την αγρονομική αξιολόγιση τους με έμφαση στα χαρακτηριστικά της τελικής απόδοσης και της πρωϊμότητας στην άνθιση και στον σχηματισμό λοβών. Αναφορικά με το πρώτο σκέλος της διατριβής, έγινε εφικτή η υπογενωμική κλωνοποΐηση συνολικά τριών υψηλά υδρόφιλων περιοχών της PvLHY πρωτεΐνης σε πλασμιδιακό φορέα υπερέκφρασης. Επιπρόσθετα οι τρεις GST χιμαιρικές πρωτεΐνες που προέκυψαν, υπερεκφράστηκαν με επιτυχία σε βακτηριακά κύτταρα του στελέχους BL-21 της Ε. coli ακολουθώντας δύο διαφορετικές συνθήκες υπερέκφρασης. Εν συνεχεία έγινε επιτυχής αποκοπή του C; αντιγόνου από τη GST χιμαιρική μορφή του έπειτα από εξειδικευμένη πρωτεόλυση με τη χρήση του παράγοντα Xa. Την αδυναμία εντοπισμού του Ci αντιγόνου έπειτα από την αποκοπή του, φιλοδοξεί να υπερκεράσει η συμπύκνωση των δειγμάτων έπειτα από καταβύθιση παρουσία ακετόνης. Κατά τη φυλογενετική ανάλυση των έντεκα πληθυσμών, έγινε εφικτός ο διαχωρισμός των δύο ειδών. Ο πληθυσμός της Ροδόπης που ανήκει στο Phaseolus vulgaris ομαδοποιήθηκε σε δύο βασικά ομοειδή υποσύνολα, ενώ προέκυψαν και δύο μη τυπικοί γενότυποι που ομαδοποιήθηκαν με ανεξάρτητο τρόπο από τους υπόλοιπους. Το είδος της στρωμάτωσης του συγκεκριμένου πληθυσμού φανερώνει ότι αυτός πιθανότατα προήλθε από δύο συγγενικούς προγονικούς γενότυπους, η αυτογονιμοποίηση των οποίων έδωσε τις δύο συγγενικές καθαρές σειρές που παρατηρήθηκαν. Οι γενότυποι του πληθυσμού των Γρεβενών που ανήκουν στο είδος Phaseolus coccineus ομαδοποιήθηκαν σε τρία ομοειδή υποσύνολα, φανερώνοντας ότι ο συγκεκριμένος πληθυσμός αποτελείται από ένα μείγμα ετεροθαλλικών οικογενειών στενής γενετικής βάσης. Οι πληθυσμοί του είδους Phaseolus vulgaris που προέρχονται γεωγραφικά από την περιοχή της Μαγνησίας ομαδοποιήθηκαν με κοινό τρόπο. Εξαίρεση αποτελεί ο πληθυσμός Καφετί Βυζίτσας που ομαδοποιήθηκε μαζί με τους πληθυσμούς Χονδρά Καστοριάς και Βελεστίνου, υποδηλώνοντας πιθανότατα μια κοινή καταγωγή των τριών παρότι αυτοί είναι γεωγραφικά απομονωμένοι. Αναφορικά με την σύγκριση των αποτελεσμάτων της μοριακής φυλογενετικής ανάλυσης και της ομαδοποίησης με βάση την αγρονομική αξιολόγιση των παραπάνω γενοτύπων, υψηλή ταύτιση μεταξύ των δύο μεθόδων σημειώθηκε μόνο στους γενοτύπους του πληθυσμού των Γρεβενών όπου το ποσοστό συμφωνίας των αποτελεσμάτων των δύο μεθόδων ήταν της τάξης του 75 %. Τα αντισώματα έναντι της PvLHY πρωτεΐνης, θα χρησιμοποιηθούν μελλοντικά με σκοπό να κατανοηθεί σε μεγαλύτερο βαθμό η συμβολή του συγκεκριμένου παράγοντα στο βιολογικό ρολόι του είδους Phaseolus vulgaris, ενώ παράλληλα η διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων του εν λόγω παράγοντα με άλλα στοιχεία του Παρασκευή αντισώματος έναντι του PvLHY και (ουλονενετική ανάλυση στο νένοε Phaseolus 133 ρολογιού θα φανερώσει σημαντικές πτυχές της κιρκαδικής ρύθμισης στο άνωθεν καλλιεργούμενο είδος. Η φυλογενετική ανάλυση με βάση μοριακά δεδομένα φαίνεται ότι παρέχει αξιόπιστα αποτελέσματα και είναι δυνατός ένας επικουρικός ρόλος της σε μελλοντικά βελτιωτικά προγράμματα. Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων τέτοιων μελετών με αναλύσεις δεδομένων αγρού θα παρέχει αντικειμενικότερη και πιο αξιόπιστη επιλογή των γενοτύπων που θα προκρίνονται στα πλαίσια μελλοντικών βελτιωτικών προγραμμάτων ενώ μια ενδελεχής μοριακή σάρωση του γενώματος με πολλούς τύπους μοριακών δεκτών θα ανοίξει πολλές προοπτικές για εφαρμογή της σύγχρονης μεθοδολογίας της γενετικής βελτίωσης στο είδος και θα αποτελέσει a priori ένα είδος μοριακής ταυτότητας για τις καλλιεργούμενες ποικιλίες που πρόκειται να δημιουργηθούν και με την συμβολή αυτής. Η αξιοποίηση και συνδυασμός της μελέτης της PvLHY πρωτεΐνης και άλλων στοιχείων του κιρκαδικού ρολογιού στο φασόλι με τη βοήθεια αντισωμάτων, με όσα αναφέρθηκαν παραπάνω σχετικά με τη βελτίωση στο ίδιο είδος θα κάνει εφικτή για πρώτη φορά την εισαγωγή του φωτός, ενός παράγοντα που συμμετέχει καθοριστικά στην ευρωστία των φυτών, στον σχεδίασμά των μελλοντικών γενοτύπων. Την σημασία αυτού του εγχειρήματος υπογράφει ο ρόλος του κιρκαδικού ρολογιού για τους οργανισμούς καθώς αποτελεί έναν ενδογενή μηχανισμό καταγραφής του χρόνου, ο οποίος εν είδει μα.έστρου συντονίζει πλήθος φυσιολογικών λειτουργιών με τις περιοδικές εναλλαγές φωτός και σκότους κατά την εικοσιτετράωρη περιστροφή της Γης γύρω από τον άξονα της, αυξάνοντας έτσι μεταξύ άλλων τη γενικότερη ευρωστία του φυτού και επιτρέποντας τη βέλτιστη εκμετάλλευση της δεσμευόμενης ενέργειας κατά τη φωτοσύνθεση.