Απομόνωση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν ειδικά με τη φωσφορυλιωμένη μορφή του HIF1-α από κύτταρα HeLa

Abstract

Ο HIF-la, αποτελεί τη ρυθμιζόμενη υπομονάδα του επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα HIF-1. Ο HIF-1 ρυθμίζει, σαν απόκριση στην υποξία, την έκφραση μιας μεγάλης ομάδας γονιδίων, που σχετίζονται με την ερυθροποίηση, την αγγειογένεση, το μεταβολισμό και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. FI ρύθμιση του HIF-la γίνεται σε διάφορα επίπεδα ενώ σημαντικό ρόλο σε αυτήν παίζουν οι μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις του. Η φωσφορυλίωση του HIF-la από την ρ44/42 ΜΑΡΚ στις σερίνες 641 και 643 έχει σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του HIF-la μέσω της συσσώρευσης του στον πυρήνα λόγω της απόκρυψης ενός γειτονικού σήματος πυρηνικής εξαγωγής (NES). Επιπλέον είναι πιθανόν η φωσφορυλίωση αυτή να προκαλεί την ειδική αλληλεπίδραση του HIF-la με κάποιες πρωτεΐνες του πυρήνα, που υποβοηθούν τη δράση του. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η απομόνωση και ταυτοποίηση πρωτεϊνών του πυρήνα που αλληλεπιδρούν ειδικά με την τροποποιημένη στη σερίνη 641 μορφή του HIFl-a. Για το σκοπό αυτό έγινε η κλωνοποίηση ενός μικρού τμήματος (MTD) του HIFl-a που φέρει τη φωσφομιμητική μετάλλαξη Ser641 ->Glu καθώς και του τμήματος (348-826) του HIF-la που φέρει τη συγκεκριμένη μετάλλαξη σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα (pGEX-4T-l) ώστε να εκφραστούν σε βακτήρια ως πρωτεΐνες σύντηξης με τη GST. Μόνο η GST-MTD S->E εκφράστηκε επιτυχώς. Η GST-MTD S->E χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια σε συνδυασμό με τις GST, GST-MTD wt και GSTMTD S->A (που φέρει τις μεταλλάξεις Ser641 ->Ala και Ser643->Ala που δεν επιτρέπουν τη φωσφορυλίωση) σε δοκιμή αλληλεπίδρασης με πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων HeLa χρησιμοποιώντας ακινητοποιημένες σε σφαιρίδια πρωτεΐνες (pull down assay). Από το πείραμα αυτό προέκυψαν δύο πρωτεΐνες που φαίνεται να αλληλεπιδρούν ειδικά με την MTD S->E. Η πρώτη με Μ.Β. 42kDa, η οποία δεν κατέστη δυνατόν να ταυτοποιηθεί, και η δεύτερη με Μ.Β. lOOkDa, η οποία με φασματοσκοπία μάζας ταυτοποιήθηκε ως η πρωτεΐνη TUT-4.