Μοριακή αξιολόγηση και διαλογή γενοτύπων ακτινιδιάς με χρήση δεικτών μικροδορυφορικού DNA

Abstract

Ένα νέο είδος, που έχει πρόσφατα καταστεί καλλιεργήσιμο, είναι η ακτινίδιά και αποτελεί ίσως την μοναδική περίπτωση οπωροφόρου με οικονομική σημασία που έχει ανακαλυφθεί τον τελευταίο αιώνα. Η εξάπλωση του ξεκίνησε από την Ν. Ζηλανδία με την ποικιλία Hayward (A. deliciosa- 2n = 6x) και αποτελεί την κύρια ποικιλία (πάνω από 90%) στην οποία στηρίζεται η παγκόσμια παραγωγή. Έτσι το ενδεχόμενο γενετικής ευπάθειας, ανάλογη μ' αυτήν του καλαμποκιού στις Η.Π.Α. στην δεκαετία του 60 δεν μπορεί να αποκλεισθεί και επομένως είναι αναγκαία η δημιουργίας νέων ποικιλιών είτε του ιδίου είδους (A. deliciosa) ή και άλλου είδους (.A. chinensis 2n = 4χ ή 2n = 2χ). Για την αξιοποίηση όμως των νέων γενοτύπων ακτινιδιάς θα πρέπει πρώτα να διερευνηθεί η γεντική τους βάση και η ύπαρξη γενετικής παραλλακτικότητας. Πέρα από τις μεθόδους της κλασικής γενετικής υπάρχουν και νέες μέθοδοι μοριακής γενετικής ανάλυσης μέσο μοριακών δεικτών. Στην παρούσα εργασία οι μοριακοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν επαναλαμβανόμενες μικροδορυφορικές ακολουθίες (SSRs) γιατί α) αντιστοιχούν σε μία και μόνη γενωμική περιοχή β), είναι συγκυρίαρχοι δείκτες που εμφανίζουν πολλά αλληλόμορφα και γ) χαρακτηρίζονται από επαναληψημότητα τόσο στο χρόνο όσο και από διαφορετικά εργαστήρια. .Στα πλαίσια της διατριβής αξιολογήθηκαν γενότυποι, που ανήκουν στα είδη Α. chinensis και A. deliciosa οι οποίοι υποβλήθηκαν σε μοριακή γενετική αξιολόγηση. Στην παρούσα εργασία παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της μοριακής αξιολόγησης με σκοπό την διερεύνηση της δυνατότητας ιχνηλάτησης του γενώματος με PCR ανάλυση πολυμορφισμών, αποτύπωσης και ταυτοποίησης με δείκτες SSRs. Χρησιμοποιήθηκαν 24 γενότυποι από τους οποίους οι 13 του είδους A. deliciosa (επτά θηλυκοί και έξη άρρενες), 11 γενότυποι του είδους A. chinensis 10 τετραπλοειδείς (9 θηλυκοί και ένας άρρεν). Χρησιμοποιήθηκαν 38 εκκινητές μήκους 20 bp που δημιουργήθηκαν στο Εργαστήριο του Πανεπιστημίου του Udine κατάλληλοι για την ιχνηλάτηση του γενώματος με PCR ανάλυση πολυμορφισμών μικροδορυφορικού DNA. Έγινε εξαγωγή του DNA, PCR και ανάλυση προϊόντων σε πηκτή πολυακρυλαμίδης 8%, ενώ εκτιμήθηκαν ο αριθμός αλληλομόρφων, ο δείκτης πολυμορφισμού PIC {polymorphism information content), DI (Diversity indices) και I (Probability of identity). Σκοπός της παρούσης ερευνητικής εργασίας ήταν η αξιολόγηση μοριακών δεικτών μικροδορυφορικών περιοχών (SSRs) ως προς την αποτελεσματικότητα τους να διαφοροποιούν γενοτύπους ακτινιδιάς και η αποτύπωση γενοτύπων ακτινιδιάς. Οι χρωμοσωμικές περιοχές που μελετήθηκαν έδειξαν υψηλό βαθμό πολυμορφισμού που φάνηκε να αντιστοιχεί σε μέσο αριθμό 10.7±3 αλληλομόρφων με εύρος 5-17 ανάλογα με τον εκκινητή. Οι γενότυποι διαφοροποιήθηκαν ως προς το επίπεδο πλοειδίας σε εξαπλοειδείς και τετραπλοειδείς. Γενικά οι εκκινητές φάνηκε να διαφοροποιούν αποτελεσματικά τους γενοτύπους με τιμή PIC=0.805±0.128 και εύρος 0.905-0.686, DI=844±0.048 και εύρος 0.912-0.711 και Ι=0.044±0.025 και εύρος 0.015-0.108. Τα δεδομένα έδειξαν ότι υπάρχουν εκκινητές που παρουσίασαν υψηλό πολυμορφισμό για τα άτομα των ειδών A. deiiciosa και A. chinensis. Ειδικότερα για τα άτομα του είδους A. chinensis οι υποσχόμενοι εκκινητές ήταν οι UDK 96-040, UDK 96-001, UDK 96-022, UDK 96-033, UDK 97-407, UDK 97-406, UDK 97- 413, UDK 97-402, UDK 96-092, UDK 99-141 και UDK 99-168. Για τα άτομα του είδους A. deiiciosa ήταν οι UDK 96-001, UDK 96-018, UDK 96-040, UDK 96-020, UDK 96-092, UDK 96-065 b, UDK 97-414, UDK 97-704, UDK 97-413, UDK 97- 422 και UDK 99-141. Υπήρξαν μοριακοί δείκτες έδωσαν την δυνατότητα ταυτοποίησης όλων των γενοτύπων του είδους A. chinensis με έναν και μόνο εκκινητή UDK 96-092, UDK 99-141, κάτι που δεν ήταν εφικτό για τα άτομα του είδους A. deiiciosa. Κάτι που είναι εφικτό με την συνδυασμένη αξιολόγηση δύο ή περισσοτέρων εκκινητών.. Η ανάλυση των συχνοτήτων των αλληλομόρφων ως προς όλα τα άτομα των ειδών έδειξε ότι υπήρξαν μοριακοί δείκτες ικανοί να προσδιορίσουν το είδος του κάθε γενοτύπου, όσον αφορά βέβαια τους γενότυπους που ελέγθηκαν στην παρούσα εργασία. Ειδικότερα οι εκκινητές UDK 96-035α, UDK 99-156 και UDK 96-158 διαχώρισαν τους γενότυπους των δύο ειδών