Διερεύνηση του ρόλου των SR πρωτεϊνικών κινασών στην γονιδιακή έκφραση : μελέτη της βιολογικής σημασίας της μοριακής αλληλεπίδρασης ενός καινούργιου μέλους της οικογένειας της SRPK1a με τον πρωτεϊνικό παράγοντα SAFB

Abstract

Η SRPKla αποτελεί ένα νέο μέλος της οικογένειας των SR πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες φωσφορυλιώνουν υποστρώματα που περιέχουν περιοχές πλούσιες σε αργινίνη και σερίνη (μοτίβα RS). Το μετάγραφο της SRPKla προέρχεται από εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου της SRPK1 και διαφέρει μόνο κατά ένα επιπλέον εξόνιο στο 5' άκρο του. Στην παρούσα διατριβή μελετάται η βιολογική σημασία της αλληλεπίδρασης της SRPKla με έναν πρωτεϊνικό παράγοντα της πυρηνικής μήτρας, τον SAFB1, ο οποίος δεν περιέχει μοτίβο RS και άρα δεν αποτελεί φυσικό υπόστρωμα της κινάσης. Με σκοπό να μελετηθεί η επίδραση του παράγοντα SAFB1 στη δράση της SRPKla, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες in vitro φωσφορυλίωσης γνωστών υποστρωμάτων της κινάσης. Βρέθηκε ότι η δράση της SRPKla και της SRPK1 (η οποία αλληλεπιδρά σε μικρότερο βαθμό με τον SAFB1) αναστέλλεται παρουσία αυτού του παράγοντα. Επιπρόσθετες δοκιμασίες in vitro φωσφορυλίωσης έδειξαν ότι η πλούσια σε διπεπίδια RE περιοχή του SAFB1 που προσομοιάζει χημικά με φωσφορυλιωμένη αλληλουχία RS, δεν ευθύνεται για την συμπεριφορά του ως αναστολέα καθώς παρουσία του SAFB1 χωρίς αυτή τη περιοχή αναστέλλεται και πάλι η δράση της SRPKla, ενώ παρουσία του SAFB2, ο οποίος επίσης περιέχει στο καρβοξυτελικό του άκρο περιοχή πλούσια σε RE, η δράση της κινάσης δεν αναστέλλεται. Στα πλαίσια της διερεύνησης της επίδρασης του παράγοντα SAFB1 στον κυτταρικό εντοπισμό της SRPKla, πραγματοποιήθηκαν πειράματα φθορισμού- ανοσοφθορισμού μετά από συνέκφραση των δύο πρωτεϊνών σε κύτταρα HeLa. Παρατηρήθηκε ότι ενώ απουσία του SAFB1 η SRPKla εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και λιγότερο στον πυρήνα, παρουσία του SAFB1 ο κυτταρικός εντοπισμός της γίνεται αποκλειστικά πυρηνικός. Παράλληλα διερευνήθηκε και η επίδραση του SAFB2 στον εντοπισμό της SRPKla παρουσία του οποίου βρέθηκε ότι η κινάση παραμένει κυρίως κυτταροπλασματική. Η διαφορετική επίδραση του SAFB1 σε σχέση με τον SAFB2 στη δράση και τον εντοπισμό των κινασών φαίνεται από αποτελέσματα πειραμάτων χρωματογραφίας αγχιστείας να αντικατοπτρίζει τη διαφορετική αγχιστεία που παρουσιάζουν οι παράγοντες SAFB για τις δύο κινάσες. Τέλος, προκειμένου να αποκαλυφθούν νέες ιδιότητες του SAFB1 που πιθανόν παίζουν ρόλο στη λειτουργική του σχέση με την SRPKla είχε γίνει αναζήτηση νέων μοριακών παρτενέρ του SAFB1 μέσω του συστήματος των δύο υβριδίων. Από τις νέες μοριακές αλληλεπιδράσεις του SAFB1 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη η πρωτεΐνη ERH, η οποία αλληλεπιδρά ισχυρά με τον SAFB1 αλλά όχι με τον SAFB2 (όπως και η SRPKla). Με πειράματα χρωματογραφίας αγχιστείας επιβεβαιώθηκε in vitro η ικανότητα δομικής διάκρισης της ERH μεταξύ των SAFB1 και SAFB2.