Κλωνοποίηση, υπερέκφραση και μελέτη των επικρατειών A1 και A2 του παράγοντα πήξης του αίματος von Willebrand

Abstract

Ο ρόλος του παράγοντα von Willebrand είναι καθοριστικός για την αιμόσταση, διότι αφενός είναι υπεύθυνος για την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο ενδοθήλιο του τραυματισμένου αγγείου και αφετέρου διατηρεί την ακεραιότητα του παράγοντα VIII της πήξης, με τον οποίο συνδέεται, προστατεύοντάς τον από πρωτεολυτική καταστροφή στην κυκλοφορία. Ελαττωμένη δράση του vWF, είτε λόγω ανεπαρκούς παραγωγής είτε λόγω παρουσίας δυσλειτουργικών μορφών του, προκαλεί αιμορραγική διάθεση. Αντίθετα, αυξημένη δράση του παράγοντα ως αποτέλεσμα διαταραχής του καταβολισμού του αυξάνει τον κίνδυνο θρομβώσεων. Το πρώιμο προϊόν του γονιδίου του vWF, είναι μια πρωτεΐνη 2.813 αμινοξέων. Διαφορετικές πρωτεΐνες αντιστοιχούν στους τέσσερις τύπους επαναλαμβανόμενων περιοχών (Dl, D2, D’, D3, Al, Α2, A3, Α4, D4, Β, C1,C2 ) του cDNA, και είναι υπεύθυνες για διαφορετικά χαρακτηριστικά δέσμευσης του μορίου. Η A1-περιοχή αντιστοιχεί στα κατάλοιπα 497-716 του ώριμου vWF και το αμινοτελικό άκρο της συνδέεται με το καρβοξυτελικό άκρο της μέσω ενός δισουλφιδικού δεσμού ανάμεσα στις Cys509 και Cys695. Η θηλιά αυτή εμπλέκεται στην δέσμευση του vWF στον γλυκοπρωτεινικό υποδοχέα lb των αιμοπεταλίων (GPIb). Η Α2-περιοχή του vWF αντιστοιχεί στα κατάλοιπα 717-909 και δεν περιέχει δισουλφιδικό δεσμό ανάμεσα στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό της άκρο. Περιέχει μια φυσιολογική θέση πέψης μεταξύ των Tyr842 και Met843 την οποία αναγνωρίζει η μεταλλοπρωτεάση ADAMTS-13 και συνδέεται με την φυσιολογική ανακύκληση του vWF. Από μελέτες φαίνεται πως η Α2 περιοχή συνδέεται στην Α1 και εμποδίζει την σύνδεση της στα αιμοπετάλια και άρα την πήξη του αίματος. Από αυτή την διαπίστωση προκύπτει ότι αν βρεθούν στοιχεία για την αλληλεπίδραση των δύο επικρατειών θα μπορέσουν να σχεδιαστούν κατάλληλα μόρια που θα συνδέονται στην A1-περιοχή, μιμούμενα τον τρόπο σύνδεσης της Α2-περιοχής και έτσι θα εμποδίζεται η πήξη του αίματος. Συνεπώς τα μόρια αυτά θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως αντιθρομβωτικοί παράγοντες. Για να μελετηθεί λοιπόν η αλληλεπίδραση των επικρατειών Α1 και Α2, αυτές κλωνοποιήθηκαν και έπειτα οι αντίστοιχες πρωτεΐνες υπερεκφράστηκαν και καθαρίστηκαν. Στοιχεία για την αλληλεπίδραση τους δόθηκαν μέσω ενός πειράματος ITC.