Μελέτες στη βιολογική σημασία της ανθρώπινης πολυ(Α) - εξειδικευμένης ριβονουκλεάσης

Abstract

Η ττολύ(Α) ουρά των ώριμων ευκαρυωτικών mRNAs διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην μεταφορά, την μετάφραση και την αποικοδόμηση τους, παρέχοντας ένα σημαντικό μέσο ελέγχου της πρωτεϊνοσύνθεσης και της σταθερότητας των mRNAs. Η αποικοδόμηση των mRNAs ξεκινά συνήθως με τη βράχυνση της πολυ(Α) ουράς, με τα ένζυμα που συμμετέχουν στη διαδικασία να χαρακτηρίζονται από διαφορετικούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς, βιολογικές λειτουργίες και εξειδίκευση ως προς το mRNA-υπόστρωμα. Η βράχυνση της ουράς καταλύεται από ένζυμα γνωστά ως αποαδενυλάσες. Ο ρόλος της ύπαρξης πολλών τέτοιων ενζύμων που επιτελούν τη συγκεκριμένη διεργασία δεν έχει ακόμη αποσαφηνιστεί. Επιχειρούμε να προσεγγίσουμε το ερώτημα αυτό αποσιωπόντας κάποιες σημαντικές ευκαρυωτικές αποαδενυλάσες και αναλύοντας την επίδραση στα επίπεδα έκφρασης επιλεγμένων mRNAs. Στην παρούσα εργασία, εξετάστηκε η επίδραση της αποσιώπησης της ανθρώπινης πολυ(Α)-εξειδικευμένης ριβονουκλεάσης (PARN), στα επίπεδα έκφρασης των επιλεγμένων παραγόντων, στα πλαίσια μιας πρώτης προσπάθειας για τον προσδιορισμό των mRNA-στόχων της κάθε αποαδενυλάσης. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάστηκαν 4 κατάλληλα shRNAs για την ειδική σίγηση της PARN και με αυτά διαμολύνθηκαν ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα Hep2. Με ανοσοαποτύπωση και ποσοτική Real Time PCR ελέγξαμε σε επίπεδο πρωτεϊνών και mRNA αντίστοιχα, την επιτυχία της αποσιώπησης και τα επίπεδα έκφρασης των εξεταζόμενων παραγόντων σε εκχυλίσματα κυττάρων αγρίου τύπου και κυττάρων διαμολυσμένων με τα shRNAs. Σύγκριση του προτύπου έκφρασης μετά από αποσιώπηση της PARN με τα αντίστοιχα από την αποσιώπηση άλλων σημαντικών αποαδενυλασών όπως η CNOT7, φανερώνει κάποια διαφορετικότητα όσων αφορά τουλάχιστον σε ορισμένα mRNAs.