Υπερέκφραση, απομόνωση και δομική μελέτη του καρβοξυτελικού τμήματος 348-826 με μια αντικατάσταση S-E στη θέση 641 του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα 1α (HIF1α)

Abstract

Ο επαγό μένος από την υποξία παράγοντας HIF-1, αποτελεί σημείο κλειδί στην απόκριση των κυττάρων σε συνθήκες υποξίας. Ο HIF-1 αποτελείται από δυο υπομονάδες: την HIF-la και HIF-Ιβ, οι οποίες έχουν δυο χαρακτηριστικές περιοχές, μια περιοχή με μοτίβο έλικας- θηλιάς- έλικας (bHLH) καθώς και μια περιοχή PAS. Οι bHLH περιοχές είναι υπεύθυνες για το διμερισμό των δυο υπομονάδων και την σύνδεση ενός μεγάλου αριθμού μεταγραφικών παραγόντων στο DNA, ενώ η περιοχή PAS εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαφόρων πρωτεϊνών. Το καρβοξυτελικό άκρο του HIF-la περιέχει επίσης μια περιοχή, η οποία είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση του HIF-la σε φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου (ODD) και δυο περιοχές μεταγραφικής ενεργοποίησης, τις Ν- TAD και CTAD, οι οποίες φαίνεται να εμπλέκονται στη σύνδεση άλλων συν-ενεργοποιητών. Υπο φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου, ο HIF-la υδροξυλιώνεται σε κατάλοιπα προλίνης από τις προλυλο- υδροξυλάσες και αυτό οδηγεί τον HIF-la σε ουβικουιτινίωση και αποικοδόμηση μέσω της 26S υπομονάδας του πρωτεασώματος. Επιπλέον, η υδροξυλίωση ενός καταλοίπου ασπαραγίνης από την πρωτεΐνη FIH- 1 εμποδίζει τη δέσμευση των μεταγραφικών συν- ενεργοποιητών στον HIF-la και τον καθιστά μεταγραφικά ανενεργό. Σε συνθήκες χαμηλής διαθεσιμότητας οξυγόνου, η δράση των προλυλο- υδροξυλασών εξασθενίζει , με αποτέλεσμα ο HIF-la να μην αποικοδομειται. Ταυτόχρονα, σε συνθήκες υποξίας αναστέλλεται η δράση της πρωτεΐνης FIH- 1, με αποτέλεσμα το κατάλοιπο ασπαραγίνης να μην υδροξυλιώνεται και να παραμένει ελεύθερη για τη δέσμευση των μεταγραφικών συν- ενεργοποιητών στον HIF-la. Ο σταθερός πλέον HIF-la καθίσταται ικανός να εισέλθει στο πυρήνα και να διμεριστεί με τον ARNT, επάγοντας την έκφραση πλήθους γονιδίων. Η ρύθμιση του HIF-la συμβαίνει σε πολλαπλά επίπεδα όπως στην ενεργοποίηση του HIF-la και σταθεροποίησή του, στην δημιουργία ετεροδιμερούς με τον HIF-1 β και την επικείμενη επαγωγή της μεταγραφής γονιδίων, στην αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες, στις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, κ.α. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση και απομόνωση του καρβοξυτελικού τμήματος ,του HIF-la, 348-826 με μια μετάλλαξη S --> E στη θέση 641 ώστε να μελετηθεί πως επηρεάζει αυτή η αντικατάσταση τη δομή και τη λειτουργία της πρωτεΐνης.