Κλωνοποίηση και έκφραση των NS4b πρωτεϊνών των υποτύπων 1a, 4p και 6a του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) σε προκαρυωτικά κύτταρα E. coli

Abstract

Ο ιός της ηπατίτιδας C είναι ένα RNA ιός θετικής πολικότητας και ανήκει στην οικογένεια Flaviviridae. Εξαιτίας σημαντικών γενετικών διαφορών δεν ανήκει στην ίδια οικογένεια με τους όιλλους ηπατοιούς. Κατορθώθηκε να κλωνοποιθεί και να απομονωθεί το γένωμα του το 1989 από μια ομάδα ερευνητών. Μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί και απομονωθεί τα λεγάμενα 1 quasispeici.es του ιού, δηλαδή του διάφορους υπότυπους. Όλοι οι υπότυποι διαφέρουν ελάχιστα γενετικά μεταξύ τους και σχετίζονται στενά. Η διάδοση του ιού διαφέρει παγκοσμίως όπως και η επικράτηση σε συγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές των διάφορων υποτύπων του. Η μελέτη των υποτύπων της ηπατιτίδας C προσφέρι πολύτιμα στοιχεία γνώδης πάνω στον μηχανισμό δράσης του ιού, αλλά και απαντά σε ερωτήματα όπως η διαφορετική παθογένεια που παρουσιάζει ο ιός κατά την εξέλιξη της νόσου, όπως και την διαφορετικότητα της ανταπόκρισης των ιών στα αντιικά φάρμακα. Ο κύκλος αντιγραφής του ηπατοϊου, ακολουθεί την γνωστή πορεία ενός ιού με μονόκλωνο θετική πολικότητας RNA γένωμα το οποίο περιλαμβάνεται μέσα σε ένα εικοσαεδρικό καψίδιο με λιποπρωτεϊνικό περίβλημα. Η έκφραση του γενώματος του παράγει μια πολυπρωτέΐνη (3000 aa) όπου κατά την πέψη της, εκτός των άλλων, παράγεται και η πρωτεΐνη NS4b με την οποία ασχολείται η παρούσα πειραματική εργασία. Η ιική πρωτεΐνη NS4b εμπλέκεται σε πολλές διαδικασίες κατά τη μόλυνση των ηπατοκυττάρων από τον ιό. Παρόλο που έχει επιτευχθεί η ανάλυση όλων σχεδόν των όιλλων πρωτεϊνών του HCV, οι λειτουργίες και τα χαρακτηριστικά της NS4b δεν έχει κατορθωθεί να αποσαφηνιστούν πλήρως. Όπως και άλλες πρωτεΐνες του ιού έτσι και η NS4b αποτελεί αντιγόνο του ιού και δέχεται τη λεγάμενη «αντιγονική πίεση» από τα αντισώματα του ανθρώπινου οργανισμού. Λόγω αυτού του γεγονότος μπορεί να αποτελέσει ένα σημαντικό εργαλείο για την κατασκευή ανοσοδιαγνωστικών μεθόδων για την διάγνωση της ασθένειας σε ορούς ασθενών. Στο παρόν πείραμα πραγματοποιήθηκε η κλωνοποίηση των γονιδίων NS4b τριών υποτύπων του HCV, των la, 4ρ και 6a και η προκαρυωτική έκφραση των αντίστοιχων πρωτεϊνών με τη χρήση του ρΕΤ system manual. Ο απώτερος στόχος της όλης πειραματικής διαδικασίας είναι η δημιουργία νέας δοκιμασίας (test) με το οποίο να μπορούν να ανιχνευθούν αντισώματα στον ορό των ασθενών όχι μόνο γενικά για τον HCV αλλά και συγκεκριμένα για τον κάθε υπότυπο του. Δηλαδή οι μικρές αυτές διαφορές στην γενετική αλληλουχία των τριών NS4b γονιδίων χρησιμοποιούνται και εκμεταλλεύονται στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Η παραγωγή των ανασυνδιασμένων ιικών πρωτεϊνών παρέχει τη δυνατότητα μελέτης της δομής τους των βιοχημικών τους λειτουργιών και αλληλοεπιδράσεων όπως επίσης την προσέγγιση των παθογενετικών τους λειτουργιών, με σκοπό την μελλοντική αξιόπιστη ανίχνευση αντισωμάτων του κάθε τύπου ιού στον ορρό του ασθενούς αλλά και στην πιθανή δημιουργία εξειδικευμένων φαρμακευτικών ουσιών για την καταπολέμηση της νόσου.