Υπερέκφραση, απομόνωση και δομική μελέτη του καρβοξυτελικού τμήματος 348-826 του επαγώμενου από την υποξία παράγοντα-1a (HIF-1a)

Abstract

Ο επαγώμενος από την υποξία παράγοντας-1 (HIF-1), είναι ο κύριος μεταγραφικός ενεργοποιητής και ο παράγοντας κλειδί της απόκρισης των κυττάρων στη μειωμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου. Αποτελείται από δυο υπομονάδες, την HIF- 1α και HIF-Ιβ (ή ARNT), οι οποίες έχουν δυο χαρακτηριστικές περιοχές, μια περιοχή με μοτίβο έλικας- θηλιάς- έλικας (bHLH) καθώς και μια περιοχή PAS. Οι bHLH περιοχές είναι υπεύθυνες για το διμερισμό των δυο υπομονάδων και την σύνδεση ενός μεγάλου αριθμού μεταγραφικών παραγόντων στο DNA, ενώ η περιοχή PAS εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαφόρων πρωτεϊνών. Το καρβοξυτελικό άκρο του HIF-la περιέχει επίσης μια περιοχή, η οποία είναι υπεύθυνη για την αποικοδόμηση του HIF-la σε φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου (ODD) και δυο περιοχές μεταγραφικής ενεργοποίησης, τις Ν- TAD και C- TAD, οι οποίες φαίνεται να εμπλέκονται στη σύνδεση άλλων συν-ενεργοποιητών όπως p300/CBP. Υπο φυσιολογικές συνθήκες οξυγόνου (normoxia), ο HIF-la υδροξυλιώνεται σε κατάλοιπα προλίνης από τις προλυλο- υδροξυλάσες και αυτό έχει ως αποτέλεσμα την δέσμευση της VHL πρωτεΐνης στην ODD περιοχή του HIF-la. Η δέσμευση αυτή οδηγεί τον HIF-la σε ουβικουιτινίωση και αποικοδόμηση μέσω της 26S υπομονάδας του πρωτεασώματος. Επιπλέον, η υδροξυλίωση ενός καταλοίπου ασπαραγίνης από την πρωτεΐνη FIH- 1 εμποδίζει τη δέσμευση των μεταγραφικών συν- ενεργοποιητών στον HIF-la και τον καθιστά μεταγραφικά ανενεργό. Σε συνθήκες χαμηλής διαθεσιμότητας οξυγόνου (hypoxia), εξασθενίζει η δράση των προλυλο- υδροξυλασών, με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η δέσμευση των pVHL στον HIF-la και η μετέπειτα αποικοδόμησή του. Ταυτόχρονα, σε συνθήκες υποξίας αναστέλλεται η δράση της πρωτεΐνης FIH- 1, με αποτέλεσμα η Asn803 να μην υδροξυλιώνεται και να παραμένει ελεύθερη για τη δέσμευση των μεταγραφικών συν- ενεργοποιητών στον HIF-la. Τα σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν στην αναστολή της δράσης των προλυλο- υδροξυλασών και των υδροξυλασών ασπαραγίνης παραμένουν ασαφή. Ο σταθερός πλέον HIF-la καθίσταται ικανός να εισέλθει στο πυρήνα και να διμεριστεί με τον ARNT, επάγοντας την έκφραση πλήθους γονιδίων. Η ρύθμιση του HIF-la συμβαίνει σε πολλαπλά επίπεδα όπως στην ενεργοποίηση του HIF-la και σταθεροποίησή του, στην δημιουργία ετεροδιμερούς με τον HIF-Ιβ και την επικείμενη επαγωγή της μεταγραφής γονιδίων, στην αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες, στις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, κ.α. Ο HIF-la ως μεταγραφικός παράγοντας, ο οποίος εμπλέκεται στην έκφραση πλήθους γονιδίων υπόκειται και ο ίδιος σε μια σειρά μεταμεταφραστικών τροποποιήσεων που σαν σκοπό έχουν την ρύθμιση της λειτουργίας του. Οι τροποποιήσεις αυτές συμβαίνουν στο καρβοξυτελικό τμήμα του HIF-la, όπου εδράζονται η ODD περιοχή και οι δυο περιοχές ενεργοποίησης της μεταγραφής (Ν-TAD και C-TAD). Στη παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση και απομόνωση του καρβοξυτελικού τμήματος 348-826 του HIF-la, προκειμένου να γίνει μελέτη των δομικών χαρακτηριστικών της πρωτεΐνης (α- έλικα, β- φύλλο, β- στροφή) με τη φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού.