Μοριακή ανάλυση του Pdr5 ABC μεταφορέα

Abstract

Κατά χη διάρκεια των τελευταίων ετών, το φαινόμενο της πλειοτροπικής αντίστασης στα φαρμάκα (PDR) έλαβε ιδιαίτερη προσοχή, λόγω του ότι παθογόνοι μύκητες, όπως οι Candida Albicans, Canida Glabrata και Aspergillus Fumigatus, εμφανίζουν αντίσταση στη θεραπεία. Ο περιορισμένος αριθμός των αντιμυκητισιακών φαρμάκων που είναι διαθέσημα για τη θεραπεία των ασθενών με εξασθενιμένα ανοσοποιητικά συστήματα (όπως ασθενείς μετά από μεταμόσχευση, αλλά και ασθενείς με AIDS και καρκίνο) γέννησε την ανάγκη για μία καλύτερη κατανόηση του φαινομένου. Τα δίκτυα PDR του μη παθογενούς S. cerevisiae και των ανθρώπινων παθογόνων μυκήτων είναι πολύ παρόμοια. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η ζύμη S. cerevisiae αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο στις μελέτες μας πάνω στο PDR φαινόμενο. Σε όλους τους γνωστούς μύκητες η μεταφορά των ξενοβιοτικών ουσιών δια μέσου της κυτταποπλασματικής μεμβράνης διαμεσολαβείται κυρίως μέσω των μεταφορέων ABC. Αυτοί οι μεταφορείς διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην αναγνώριση και την εξώθηση τοξικών ουσιών, χρησιμοποιώντας την ενέργεια της υδρόλυσης ΑΤΡ προκειμένου να μεταφεθούν αυτές τις ενώσεις. Ένας από τους σημαντικότερους μεταφορείς ABC, ή ίσως ο σημαντικότερος, που συμμετέχει στο δίκτυο PDR στη ζύμη S. cerevisiae είναι ο Pdr5 μεταφορέας. Το PDR5 γονίδιο κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική ΑΤΡ-δεσμευτική πρωτεΐνη, η οποία είναι αρμόδια για την εξώθηση μίας τεράστιας ποικιλίας τοξικών ενώσεων από τα κύτταρα της ζύμης. Πράγματι, η απώλεια του PDR5 γονιδίου οδηγεί σε δραματική ευαισθησία των κυττάρων ζύμης έναντι ενός ευρέος φάσματος διαφορετικών τοξικών πρακτόρων. Ο Pdr5, όπως όλοι οι λειτουργικοί μεταφορείς ABC, αποτελείται από δύο διαμεμβρανικές περιοχές (TMDs) και από δύο νουκλεοτιδο-δεσμευτικές περιοχές (NBDs). Όπως σε όλους τους μεταφορείς ABC, οι NBDs περιοχές περιέχουν κάποιες χαρακτηριστικές και καλά συντηρημένες ακολουθίες, όπως τα μοτίβα Α και Β, τον C- βρόχο και τα μοτίβα Η-βρόχων. Οι NBDs ενεργούν ως οι μηχανικές περιοχές που παρέχουν στο μεταφορέα την απαραίτητη ενέργεια για να μεταφέρει τα τοξικά υποστρώματα. Από την άλλη, οι λιγότερο συντηρημένες TMDs περιοχές είναι αρμόδιες για τη σύνδεση και την εξώθηση των φαρμάκων. Αν και οι μεταφορείς ABC, όπως και ο καλά μελετημένος Pdr5 μεταφορέας, διαδραματίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στα δίκτυα PDR στους μύκητες, μερικές κεντρικές μηχανιστικές ερωτήσεις που αφορούν τον μηχανισμό της υδρόλυσης του ΑΤΡ αλλά και τον μηχανισμό αναγνώρισης και διακίνησης των υποστρωμάτων παραμένουν άλυτες. Προκειμένου να γίνουν κατανοητοί καλύτερα οι μοριακοί μηχανισμοί αυτών των πρωτεϊνών χρησιμοποιήσαμε την μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγέννεσης για να παραγάγουμε διάφορες μεταλλαγές στο PDR5 γονίδιο και στην συνέχεια εκτελέσαμε δοκιμές αντίστασης φαρμάκων. Τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας μπορούν να συνοψιστούν σε ένα πρότυπο με πέντε κεντρικά αξιώματα: I) Εισαγωγή των C199K, Ν334Ε, Υ367Η, Ν1011Ε, V1012G, E1013G Pdr5 σημειακών μεταλλαγών στα κύτταρα ζύμης S. cerevisiae και απόκτηση κυττάρων ζύμης που εκφράζουν τις 1) τριπλές Ν1011S-V1012G-E1013G Pdr5, 2) τις N1011SV1012G- E1013G-Y367H Pdr5, και 3) τις Ν1011S-V1012G-E1013G-Y367H-C199K Pdr5 μεταλλαγές. II) Η ευαισθησία στα φαρμάκα των κυττάρων ζύμης που φέρουν διαφορετικές μεταλλάξεις στον Pdr5 μεταφορέα εξαρτάται από τη φύση του φαρμάκου. III) Τα πειράματα αντίστασης φαρμάκων αποκαλύπτουν μια «συνομιλία» μεταξύ των NBDs και των TMDs περιοχών. IV) Η αμινοξική ασυμμετρία μεταξύ των δύο NBDs αποκαλύπτει και μια λειτουργική ασυμμετρία. V) Η μεταλλαγή Υ367Η οδήγησε σε μια σημαντική αύξηση της αντίστασης ενάντια σε όλα τα δοκιμασμένα υποστρώματα, ενώ τα κύτταρα που εκφράζουν τη μεταλλαγή C-βρόχων E1013G εμφάνησαν ιδιαίτερα ευαίσθητο φαινότυπο για όλες τις δοκιμασμένες τοξικές ενώσεις.