Δημιουργία πλασμιδιακών κατασκευών για υπερέκφραση του μορίου κυτταρικής συνάφειας TAG-1 στα ολιγοδενδροκύτταρα, στα κύτταρα Schwann και στους νευρώνες

Abstract

Τα γλοιακά κύτταρα που σχηματίζουν το έλυτρο της μυέλινης (ολιγοδενδροκύτταρα στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και κύτταρα Schwann στο περιφερικό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ)) και οι νευράξονες αλληλεπιδρούν και επηρεάζουν αμοιβαία την ανάπτυξή τους. Όπως είναι γνωστό αυτές οι αλληλεπιδράσεις είναι απαραίτητες για το σχηματισμό και τη διατήρηση των εξειδικευμένων περιοχών των νευραξόνων στις εμμύελες ίνες (π.χ. κόμβος Ranvier, παρακομβική και εγγύς παρακομβική περιοχή). Η διάκριση του νευράξονα στις περιοχές αυτές εξυπηρετεί τη συγχρονισμένη λειτουργία των τασεοελεγχόμενων διαύλων Na+ και Κ+, η οποία είναι απαραίτητη για την ταχεία αγωγή του δυναμικού ενεργείας κατά μήκος των εμμύελων ινών. Όταν η φυσιολογική δομή της περιοχής του κόμβου του Ranvier διαταράσσεται οδηγεί σε περιπτώσεις νευρολογικές διαταραχές, όπως η σκλήρυνση κατά πλάκας και το σύνδρομο Guillain-Barre. Σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση νευρώνων-γλοιακών κυττάρων, κατέχουν μόρια κυτταρικής συνάφειας που ανήκουν στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών (IgSF) και μόρια της υπεροικογένειας της neurexin/NCP, Ανάμεσα σε αυτά είναι και η πρωτεΐνη TAG-1 (IgSF), η οποία δημιουργεί ένα σύμπλοκο με την Caspr2 της οικογένειας των νευρεξινών (neurexin). Αυτό το σύμπλοκο είναι απαραίτητο για τη συσσώρευση των διαύλων Κ+ στις εγγύς παρακομβικές περιοχές, καθώς η εσκεμμένη αποδιοργάνωση του γονιδίου της TAG-1 έχει ως αποτέλεσμα τη δραματική μετατόπιση και διάχυση των καναλιών αυτών μακριά από τις εγγύς παρακομβικές περιοχές των νευραξόνων του ΚΝΣ και του ΠΝΣ. Για να διερευνήσουμε τον ακριβή ρόλο που παίζει η TAG-1 στη σωστή διαμόρφωση και λειτουργία των παρακομβικών περιοχών και για να επιμερίσουμε την TAG-1 των γλοιακών κυττάρων και των νευραξόνων θα δημιουργήσουμε πειραματόζωα που θα εκφράζουν την TAG-1 μόνο στα ολιγοδενδροκύτταρα ή στα κύτταρα Schwann ή στους νευρώνες. Για να επιτευχθεί αυτό δημιουργήθηκαν τρεις DNA κατασκευές. Η πρώτη πλασμιδιακή κατασκευή (PLP-TAG-1) οδηγεί την έκφραση του cDNA της TAG-1 στα ολιγοδενδροκύτταρα λόγω του υποκινητή του γονιδίου PLP, (που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη PLP και έχει χρησιμοποιηθεί για έκφραση πρωτεϊνών σε ολιγοδενδροκύτταρα σε διαγονιδιακά ζώα (Furiey et al., 1990; Wight et al., 1993; Fuss et al., 2001)). Η δεύτερη οδηγεί την έκφραση του cDNA της TAG-1 στα κύτταρα Schwann (κατασκευή Ρ0) και η τρίτη σε νευρώνες (κατασκευή Thyl). Η δημιουργία της πρώτης κατασκευής (PLP-TAG-1) στέφθηκε με επιτυχία. Αντιθέτως, η δεύτερη κατασκευή (P0-TAG-1) δεν ολοκληρώθηκε καθώς παρουσιάστηκαν προβλήματα κατά την κοπή και απομόνωση του τμήματος DNA το οποίο περιείχε τον υποκινητή P0(vector). Δεν υπήρχαν επίσης αρκετά στοιχεία σχετικά με τον χάρτη του τμήματος αυτού. Όσον αφορά την τρίτη κατασκευή (Thy-1-TAG-l), αρχικά έγινε προσπάθεια δημιουργίας της κατασκευής (Thy-1-TAG-l-GFP) η οποία δυστυχώς απέτυχε. Στη συνέχεια επιχειρήθηκε η δημιουργία κατασκευής (Thy-1-TAG-l) η οποία και τελείωσε επιτυχώς. Παρ όλα αυτά επειδή υπήρχαν λάθος στοιχεία σχετικά με το τμήμα του DNA που περιείχε τον υποκινητή Thy-1 (vector) η δημιουργία της κατασκευής (Thy-1-TAG-l-GFP) θα επιχειρηθεί εκ νέου με άλλο vector για τον οποίο έχουμε περισσότερα στοιχεία. Οι κατασκευές αυτές θα ενεθούν, στη συνέχεια σε προπυρήνες γονιμοττοιημένων ωοκυττάρων. Μετά από τρεις διασταυρώσεις θα δημιουργηθούν ποντίκια που θα εκφράζουν το γονίδιο της TAG-1 επιλεκτικά στα ολιγοδενδροκύτταρα ή στα κύτταρα Schwann ή στους νευρώνες μόνο, προς εξέταση του φαινοτύπου των ατόμων αυτών.