Μελέτη της βιογένεσης και μεταφοράς του tRNA : ο ρόλος του συμπλόκου της Arc1p στην αμινοακυλίωση

Abstract

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στη δημιουργία του τριμερούς συμπλόκου αμινοακυλίωσης του tRNA του S. cerevisiae, που αποτελείται από τις πρωτεΐνες Arclp, MetRS και GluRS, καθώς και ο ρόλος των μη καταλυτικών επικρατειών των δύο ενζύμων. Αρχικά χαρακτηρίστηκαν ποσοτικά οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις πρωτεΐνες του συμπλόκου χρησιμοποιώντας κυρίως τη μέθοδο συντονισμού πλασμονίων επιφάνειας στο σύστημα Biacore. Η ανάλυση αυτή έδειξε ότι η Arclp έχει μεγαλύτερη συγγένεια για την GluRS σε σύγκριση με τη MetRS, απέδειξε ότι οι καταλυτικές επικράτειες των συνθετασών δεν συμμετέχουν στη δημιουργία του συμπλόκου, και πρότεινε την ανεξάρτητη πρόσδεση των δύο συνθετασών στην Arclp. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ανάλυση της συνεισφοράς συγκεκριμένων αμινοξέων στο σχηματισμό του συμπλόκου με κατασκευή σημειακών μεταλλαγμάτων και των τριών πρωτεϊνών του συμπλόκου και τον έλεγχο της ικανότητας τους να σχηματίζουν σύμπλοκο in vivo και in vitro. Τα αποτελέσματα ταυτοποίησαν κατάλοιπα αμινοξέων που είναι σημαντικά για την κάθε αλληλεπίδραση, ποσοτικοποίησαν τη συμμετοχή τους και υπέδειξαν ότι ο σχηματισμός του συμπλόκου μεσολαβείται κατά κύριο λόγο από δυνάμεις Van der Waals. Επιπλέον, η υποκυτταρική κατανομή των σημειακών μεταλλαγμάτων απέδειξε ότι η υποκυτταρική κατανομή της MetRS εξαρτάται από τη δημιουργία συμπλόκου με την Arclp. Τέλος, για την κατανόηση του ρόλου των Ν- τελικών προεκτάσεων των δύο συνθετασών και της λειτουργίας της TRBD της Arclp, κατασκευάστηκαν χιμαιρικές πρωτεΐνες στις οποίες οι καταλυτικές επικράτειες της MetRS (ΜΚ) ή της GluRS (ΕΚ) συνδέθηκαν απευθείας στην TRBD της Arclp. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι η ΜΚ-TRBD μπορεί να υποκαταστήσει λειτουργικά το σύμπλοκο Arclp/MetRS τόσο σε σχέση με την καταλυτική του απόδοση όσο και με την υποκυτταρική του κατανομή και πρότεινε ότι ο μοναδικός ρόλος της Ν-τελικής επικράτειας της MetRS είναι η δημιουργία συμπλόκου με την Arclp. Αντίθετα, η σύντηξη της TRBD στην ΕΚ δεν επηρέασε σημαντικά την λειτουργία της καταλυτικής επικράτειας του ενζύμου, ούτε άλλαξε την υποκυτταρική του κατανομή.