Ανάπτυξη και εφαρμογή μοριακών δεικτών για την ταυτοποίηση ειδών γάλακτος

Abstract

Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε μια μοριακή τεχνική με στόχο το γρήγορο και αποτελεσματικό προσδιορισμό του είδους γάλακτος. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο μιτοχονδριακό DNA που απομονώθηκε από διάφορα δείγματα γάλακτος (αγελάδος, πρόβειο, γίδινο και μίγματα αυτών). Η τεχνική που εφαρμόστηκε ήταν η PCR-RFLP . Αφού απομονώθηκε mtDNA, ενισχύθηκε με την μέθοδο PCR τμήμα του γονιδίου cyt b. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κοινοί για τα διάφορα είδη (universal primers). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πέψεις με δύο διαφορετικά ένζυμα περιορισμού (Haelll και Mbol) και ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των τμημάτων περιορισμού σε πηκτή πολυακρυλαμίδης. Χρησιμοποιήθηκαν δείγματα γάλακτος, πρόβειου, γίδινου και αγελάδος καθώς και μιγμάτων αυτών, τα οποία αφορούν κυρίως νωπό γάλα που επί το πλείστον ελήφθη κυρίως από κτηνοτροφικές μονάδες. Εκτός των παραπάνω δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν επίσης πρότυπα δείγματα για πρόβειο, αίγειο και αγελάδος και μίγματα αυτών (πρόβειο-αίγειο, αίγειο-αγελάδος, πρόβειο-αγελάδος) που έγιναν στο εργαστήριο. Η επεξεργασία των προτύπων δειγμάτων και των μιγμάτων τους με τη μέθοδο και η σύγκριση αυτών με τα αντίστοιχα αποτελέσματα από θεωρητική επεξεργασία με τα προγράμματα βιοπληροφορικής, μας έδωσε μια πολύ καλή ταύτιση για τα προκύπτοντα τμήματα περιορισμού για το κάθε είδος, Διαφοροποίηση είχαμε μόνο για το πρόβειο και τα τμήματα περιορισμού που προκύπτουν με την πέψη με το Mbol. Το ίδιο είχαμε για το αγελαδινό. Αυτές οι διαφορές οφείλονται πιθανώς σε πολυμορφισμό εντός του είδους (πρόβειο, αγελάδος) και είναι ιδιαίτερης σημασίας η ανίχνευσή του με τη μέθοδό μας. Για τα πρότυπα και τα μίγματά τους αλλά και όλα τα δείγματα, η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης και η εμφάνιση των αποτελεσμάτων μετά από χρώση με νιτρικό άργυρο, έδωσε ευδιάκριτες ζωνώσεις που αντιστοιχούν στα τμήματα περιορισμού, ευκόλως συγκρίσιμες μεταξύ τους Επίσης για τα πρότυπα και τα μίγματά τους αλλά και όλα τα δείγματα είναι σημαντικό ότι είχαμε πολύ καλή ταύτιση των αποτελεσμάτων ταυτοποίησης που προέκυψαν για τα δύο ένζυμα Haelll και Mbol, αποδεικνύοντας ότι η χρήση τους δίνει σωστά τμήματα περιορισμού ώστε να χρησιμοποιηθούν εναλλακτικά ως μοριακοί δείκτες για την ταυτοποίηση των ειδών. Από τα 50 προς εξέταση δείγματα δεν αξιολογήθηκαν 3 δείγματα κυρίως λόγω κακών απομονώσεων, ενώ για τα υπόλοιπα 47 είχαμε πολύ καλά αποτελέσματα ως προς την ταυτοποίηση της αυθεντικότητας ή τυχόν αναμίξεων και νοθειών. Από τα 33 δείγματα πρόβειου γάλακτος όπως δηλώθηκαν , τα 19 ταυτοποιήθηκαν ως πρόβεια, για τα 12 ταυτοποιήθηκε η ύπαρξη και γίδινου γάλακτος, ενώ για τα υπόλοιπα 2 ταυτοποιήθηκε ανάμιξη και γίδινου και αγελαδινού. Από τα 6 δείγματα γίδινου, για τα δύο ταυτοποιήθηκε η ύπαρξη και πρόβειου γάλακτος. Ενώ για τα μίγματα αιγοπρόβειου η μέθοδος έδειξε ότι ήταν όντως μίγματα, ενώ όλα τα αγελαδινά δεν είχαν καμμία ανάμιξη με άλλο γάλα.