Δημιουργία "PCR arrays" για την ανίχνευση και τον μοριακό χαρακτηρισμό των νοροϊών σε μη επεξεργασμένα λύματα

Abstract

Οι νοροιοί αποτελούν σημαντικά ανθρώπινα παθογόνα, γνωστά για την πρόκληση επιδημικών εκδηλώσεων σοβαρής γαστρεντερίτιδας σε επίπεδο πληθυσμών και θεωρούνται υπεύθυνοι για πάνω από το 96% όλων των περιπτώσεων μη βακτηριακής οξείας επιδημικής γαστρεντερίτιδας Η επιτυχής κλωνοποίηση του γονιδιώματος του ιού, από δείγματα κοπράνων, επέτρεψε να χαρακτηριστεί ο ιός ως calicivirus, δηλαδή ότι κατέχει ένα γραμμικό, θετικής πολικότητας, μονόκλωνο RNA (ssRNA) γένωμα, 7,7 κιλοβάσεων περίπου, το οποίο προστατεύεται από το περιβάλλον από ένα πρωτεϊνικό καψίδιο, αλλά δεν περιβάλλεται από φάκελο. Στο 5'άκρο του γενώματος βρίσκεται συνδεδεμένη μια πρωτεΐνη (VPg) ενώ το 3'άκρο του περιλαμβάνει ουρά πολυαδενίνης (polyA). Επίσης, το ιικό γονιδίωμα οργανώνεται σε τρία ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORFs). To ORF1 κωδικοποιεί για μια πολυπρωτεΐνη, η οποία παράγει τις ώριμες μη δομικές πρωτεΐνες του ιού. Τα υπόλοιπα ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF2 και ORF3) κωδικοποιούν για τις δομικές πρωτεΐνες, εκ των οποίων η VP1 είναι υπεύθυνη για τις αντιγονικές ιδιότητες του ιού. Οι νοροιοί, ταξινομούνται ως βιολογικοί παράγοντες κατηγορίας Β, λόγω της υψηλής μολυσματικής τους ικανότητας, μικρότερη από 10 ιοσωμάτια ανά άτομο και λόγω της σταθερότητάς που παρουσιάζουν στο περιβάλλον. Η ασθένεια που προκύπτει μετά από μόλυνση με τον ιό, συνήθως, δεν διαρκεί μεγάλο χρονικό διάστημα σε υγιείς ενήλικες (12 - 24 ώρες), αλλά μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές επιπλοκές, κυρίως στις ευπαθείς ομάδες του πληθυσμού. Επίσης, οι νοροιοί δεν προκαλούν πάντα μόνιμη ανοσοποίηση και σε συνδυασμό με την σημαντική ετερογένεια και ευμεταβλητότητά τους, αποτελούν σημαντικό επιδημιολογικό κίνδυνο σε παγκόσμιο επίπεδο. Στην παρούσα διατριβή, η αρχική ανίχνευση νοροϊών, πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή της RT-PCR τεχνικής με ήδη υπάρχοντα από την βιβλιογραφία εκκινητικά μόρια και εφαρμόσθηκαν οι autonested, nested ή seminested PCR. Η ανίχνευση ενός θετικού για νοροϊούς κλινικού δείγματος, επέτρεψε την αλληλούχιση περιοχών του γονιδιώματος και την μετέπειτα χρήση των αποτελεσμάτων αυτών, για τον σχεδίασμά νέων εκκινητικών μορίων, προκειμένου να επιτευχθεί η αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος. Τελικά, επιτεύχθηκε η αλληλούχιση μιας περιοχής η οποία περιλαμβάνει το 3’ άκρο του ORF1, ολόκληρο το ORF2 και το 5’ άκρο του ORF3. Επιπλέον, από τα 11 περιβαλλοντικά δείγματα που αναλύθηκαν, προέκυψαν τρία θετικά για την παρουσία νοροϊών με προέλευση τους βιολογικούς καθαρισμούς των Τρικάλων, της Λάρισας και των Ιωαννίνων.