Κρυοδιατήρηση σπέρματος και τεχνικές εκτίμησης ποιότητας σπέρματος ιχθύων

Abstract

Η σημαντική ανάπτυξη των υδατοκαλλιεργειών, που έχει επιτευχθεί τα τελευταία χρόνια και η γνώση ότι η ποιότητα και των δυο γαμετών είναι κρίσιμη για την επιτυχία της γονιμοποίησης και την επιβίωση των προνυμφών, έδωσε ώθηση στην μελέτη του σπέρματος, στους παράγοντες που την επηρεάζουν, αλλά και στην εξέλιξη των τεχνικών διατήρησης του. Η αποθήκευση των γεννητικών προϊόντων, για μικρό ή μεγάλο χρονικό διάστημα, προέκυψε ως ανάγκη εξασφάλισης σπέρματος, κατά τη διάρκεια της τεχνητής αναπαραγωγής ή δημιουργίας ιδανικών υβριδίων μεταξύ των διάφορων ειδών και ανάμεσα σε αυτές τις τεχνικές, η αποθήκευση του σπέρματος και η κρυοδιατήρηση, είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος. Η βραχυπρόθεσμη διατήρηση του σπέρματος σε ψυκτικό θάλαμο, η οποία μπορεί να ποικίλει από ώρες σε εβδομάδες, είναι μια τεχνική, αποδοτικά χρησιμοποιούμενη στα εκκολαπτήρια, ενώ, επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της ποιότητας του σπέρματος και τον έλεγχο για ασθένειες πριν την κρυοδιατήρηση. Η επιστήμη της κρυοδιατήρησης, σχετίζεται με την μακράς διάρκειας αποθήκευση βιολογικού υλικού σε μια κατεψυγμένη, αλλά βιώσιμη κατάσταση, σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες (-196°C). Η κρυοδιατήρηση του σπέρματος και η δημιουργία τράπεζας γονιδίων, μπορεί να αποδειχθεί πολύ ωφέλιμη στις υδατοκαλλιέργειες, αλλά και για να διατηρηθεί η γενετική ποικιλότητα πληθυσμών ψαριών τα οποία κινδυνεύουν με εξαφάνιση. Η χρησιμοποίηση κρυοπροστατευτικών ουσιών, οι οποίες χρησιμοποιούνται για την προστασία βιολογικών ιστών από ζημιές κατά την κατάψυξη, είναι απαραίτητη στην κρυοδιατήρηση του σπέρματος, καθώς τα ιδανικά κρυοπροστατευτικά εισβάλλουν στο κύτταρο, ώστε να ρυθμίσουν τον σχηματισμό κρυστάλλων και, επίσης, είναι στο εξωτερικό του κυττάρου, για να ελέγχουν την συγκέντρωση αλάτων. Η κρυοζημιά που παρατηρείται στο σπέρμα μετά την κρυοδιατήρηση, είναι αποτέλεσμα της συσσωρευμένης ζημιάς των κυττάρων, οι οποίες προκαλούνται κατά τη διάρκεια της κρυοδιατήρησης και μπορεί να οδηγήσει στη μείωση της κινητικότητας και της βιωσιμότητας ή στη ζημιά της ακεραιότητας του DNA. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας, ήταν να εφαρμοστούν διαφορετικά πρωτόκολλα για την εκτίμηση της βιωσιμότητας και της ακεραιότητας του - 1 - σπέρματος και να μελετηθούν τα προστατευτικά αποτελέσματα διάφορων κρυοπροστατευτικών διαλυμάτων, για τη διαδικασία κρυοδιατήρησης, αλλά και βραχυπρόθεσμης διατήρησης του σπέρματος. Ανάμεσα στις παραμέτρους που εξετάστηκαν ήταν και η τοξικότητα, ενός ευρέως χρησιμοποιούμενου κρυοπροστατευτικού (του διμεθυλοσουλφοξειδίου, DMSO). Για τα είδη τα οποία χρησιμοποιήθηκαν δεν υπάρχει προηγούμενη πληθώρα αναφορών, όσον αφορά την εφαρμογή αυτών των τεχνικών, ενώ η κρυοδιατήρηση του σπέρματος λούτσων είναι μια τεχνική για την οποία δεν εντοπίστηκαν βιβλιογραφικές αναφορές. Επίσης, η χρήση σπέρματος από ήδη νεκρά άτομα, συνιστά πρόκληση, καθώς το σπέρμα αυτών των ατόμων δεν είναι ποιοτικά ισότιμο με αυτό των ζωντανών ατόμων. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν δύο είδη ψαριών, λούτσοι (Sphyraena sphyraena Linnaeus, 1758) και κεφάλοι (Mugil cephalus Linnaeus, 1758) τα οποία αλιεύτηκαν στην περιοχή του Αμβρακικού κόλπου και μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο Υδατοκαλλιεργειών και Εσωτερικών Υδάτων του ΤΕΙ Ηπείρου στην Ηγουμενίτσα, για την πραγματοποίηση του πειράματος. Αρχικά, εξετάστηκε η ποιότητα του σπέρματος αυτών των ψαριών, με τον υπολογισμό του ποσοστού των κινητικών σπερματοζωαρίων, της διάρκειας της κίνησης τους και του γοναδικού δείκτη. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν κατά την κρυοδιατήρηση του σπέρματος των λούτσων, έδειξαν την καταλληλότητα του διαλύματος 10% λέκιθου αυγού και 10% DMSO, ενώ στην κρυοδιατήρηση του σπέρματος των κέφαλων, παρατηρήθηκε επίσης η υπεροχή αυτού του διαλύματος. Κατά τη διατήρηση του σπέρματος των κεφάλων σε ψυκτικό θάλαμο, το καλύτερο αποτέλεσμα εμφανίστηκε με τη χρήση διαλύματος ακινητοποίησης, ενώ η χρήση του DMSO εμφάνισε τοξικά αποτελέσματα. Τα αποτελέσματα αυτά, επιβεβαιώθηκαν με διάφορες τεχνικές εκτίμησης βιωσιμότητας και ακεραιότητας του σπέρματος (Commet Assay, Sperm Chromatin Dispersion Test, χρώση με Trypan Blue), οι οποίες έχουν μέλλον στις υδατοκαλλιέργειες. Όσον αφορά την πραγματοποίηση της Commet Assay, η οποία σχετικά πρόσφατα εφαρμόστηκε στο σπέρμα ψαριών, μετά από πολλά πειράματα έγινε προςαρμογή ΤΓΙζ μεθοδολογίας και καθορίστηκε πρωτόκολλο ώστε να προσαρμοστεί στην ανίχνευση της ζημιάς στο σπέρμα των ιχθύων.