Κλωνοποίηση και φυλογενετική ανάλυση του γονιδίου Ε2 του Human Papillomavirus (HPV)-16

Abstract

Οι ιοί των ανθρωπίνων θηλωμάτων (human papillomaviruses) περιέχουν δίκλωνο, κυκλικό DNA μήκους περίπου 8000 βάσεων. Περισσότεροι από 100 γενότυποι HPV έχουν χαρακτηριστεί ενώ 40 από αυτούς μολύνουν τη γεννητική οδό. Οι ιοί HPV προκαλούν ένα ευρύ φάσμα από κακοήθεις και καλοήθεις αλλοιώσεις στον άνθρωπο. Προσβάλλουν τη βασική στοιβάδα του επιθηλίου και είναι υπεύθυνοι για την πρόκληση κοινών θηλωμάτων έως και την εμφάνιση καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, καρκίνου του πρωκτού ή του πέους. Οι ιοί HPV ταξινομούνται σε τύπους χαμηλής ή υψηλής επικινδυνότητας σύμφωνα με το βαθμό αλλοίωσης που προκαλούν. Οι HPV τύποι υψηλού κινδύνου σχετίζονται με το 90% των περιπτώσεων του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, από τις οποίες ο HPV-16 ευθύνεται για το 50% αυτών ενώ ο HPV-18 για το 10-20%. Η παρούσα εργασία ασχολείται με την κλωνοποίηση και την αλληλούχηση του γονιδίου Ε2 στελεχών HPV-16 από κλινικά δείγματα (Low και High grade) (τα οποία είναι μολυσμένα με HPV-16) με στόχο τον εντοπισμό μεταλλάξεων, οι οποίες μπορούν να συσχετιστούν με το βαθμό ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης. Η πρωτεΐνη Ε2 αποτελεί αντικείμενο μελέτης διότι παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιγραφή και τη μεταγραφή του ιικού γενώματος. Η Ε2 εμπλέκεται στη ρύθμιση της αντιγραφής των πρώιμων γονιδίων και με την πρωτεΐνη Ε1 εμπλέκονται στη ρύθμιση της αντιγραφής του ιικού γενώματος. Επίσης η Ε2 δρα ως μεταγραφικός παράγοντας και ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων Ε6 και Ε7. Για τη μελέτη της κατάστασης του γονιδίου Ε2 σχεδιάστηκαν έξι ζεύγη εκκινητικών μορίων που ενισχύουν ολόκληρο το γονίδιο Ε2 αλλά και τα επιμέρους τμήματά του. Τα προϊόντα που προέκυψαν κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν οι κλώνοι. Ακολούθησε η σύγκριση και η στοίχιση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών με προγράμματα βιοπληροφορικής. Στη συνέχεια έγινε εντοπισμός νουκλεοτιδικών και αμινοξικών αλλαγών και κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δένδρα.