Μηχανισμός παραγωγής του παράγοντα αμβλύνσεως του κύματος των γονοδοτροφίνων( gonodotrophin surge attenuating factor- GnSAF) από τα κοκκώδη κύτταρα των ωοθηκών

Abstract

Εισαγωγή: Ο παράγοντας άμβλυνσης του κύματος των γοναδοτροφινών (Gonadotrophin Surge Attenuating Factor -GnSAF) είναι μια μη στεροειδής ωοθηκική ουσία, που μέσω μια σημαντικής μείωσης της ανταπόκρισης της υπόφυσης στη GnRFI αμβλύνει το ενδογενές κύμα της LFI σε γυναίκες, οι οποίες υποβάλλονται σε θεραπεία πρόκλησης πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, ο GnSAF, του οποίου τόπος παραγωγής θεωρούνται τα ανθρώπινα κοκκώδη κύτταρα και η παραγωγή του επάγεται κυρίως από την FSFI, έχει ομολογία με το καρβοξυτελικό άκρο της ανθρώπινης λευκωματίνης (FISA). Με βάση τα παραπάνω η εργασία αυτή έχει σκοπό τη μελέτη του υπεύθυνου γονιδίου για τον παράγοντα GnSAF, έκφραση ολόκληρου ή μέρους του FISA γονιδίου από τα κοκκώδη κύτταρα γυναικών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία για εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF). Υλικό και Μέθοδοι: FI ανάλυση των HSA mRNA μεταγράφων με RT-PCR έγινε σε ωχρινποιημένα κοκκώδη κύτταρα. Η ταυτοποίηση των προϊόντων PCR έγινε με περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing). Για την κατανόηση του υποκείμενου μηχανισμού της έκτοπης αυτής έκφρασης του HSA γονιδίου στα κοκκώδη κύτταρα, μελετήθηκε η διαδικασία διασύνδεσης (απομάκρυνση εσονίων) σε δείγματα ολικού και κυτταροπλασματικού RNA. Ο ημι-ποσοτικός προσδιορισμός των τμημάτων του HSA γονιδίου έγινε σε σύγκριση με την έκφραση του γονιδίου της β-ακτίνης. Η ανάλυση κατά Northern και ο in situ υβριδισμός έγιναν με στόχο την επιπλέον διερεύνηση της έκφρασης του HSA γονιδίου από τα κοκκώδη κύτταρα. Η καλλιέργεια των κοκκωδών κυττάρων κατά τον in situ υβριδισμό έγινε παρουσία ή απουσία FSH και σημασμένος ανιχνευτής ήταν το προϊόν PCR, που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο του HSA γονιδίου. Η ανάλυση κατά Western χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της πιθανής έκφρασης της πρωτεΐνης από τα κοκκώδη κύτταρα. Αποτελέσματα: Η ανάλυση των αποτελεσμάτων RT-PCR και την ταυτοποίηση των προϊόντων PCR στα κοκκώδη κύτταρα έδειξαν ίδιες ζώνες έδειξαν ότι στο κυτταρόπλασμα των κοκκωδών κυττάρων εκφράζεται το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του FiSA γονιδίου. FI ημι-ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι τόσο το αμινοτελικό όσο και το καρβοξυτελικό άκρο του FISA γονιδίου, αντίθετα με την έκφραση των υπόλοιπων τμημάτων που είναι ελάχιστη, εκφράζονται από τα κοκκώδη κύτταρα σε συγκρινόμενες αναλογικά ποσότητες με αυτές από τα FlepG2 κύτταρα (θετικός μάρτυρας). FI ορθή διαδικασία της διασύνδεσης επιβεβαιώθηκε από την ύπαρξη σωστά μεταγραφόμενων FISA mRNA μεταγράφων (χωρίς εσόνια) στα κοκκώδη κύτταρα που αφορούν την περιοχή από το εξόνιο 12 έως το εξόνιο 13 του FISA γονιδίου. Στην ανάλυση κατά Northern, ανιχνεύθηκαν FISA mRNA μετάγραφα μόνο στα FlepG2 κύτταρα. FI απουσία εμφάνισης σήματος FISA στα κοκκώδη κύτταρα υποδηλώνει ότι η λευκωματίνη πιθανά εκφράζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα, μη ανιχνεύσιμα με αυτή τη μέθοδο. Ο in situ υβριδισμός παρουσία FSH έδειξε συγκρίσιμα επίπεδα έκφρασης του καρβοξυτελικού άκρου του FISA γονιδίου στα κοκκώδη κύτταρα με αυτά που εκφράζονται στα FlepG2 κύτταρα. Στην ανάλυση κατά Western, τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των ανθρώπινων ωχρινοποιημένων κοκκωδών κυττάρων και της κυτταρικής σειράς FlepG2 έδωσαν ζώνες μεγέθους 65 kDa, που αντιστοιχούν στο ορθό μέγεθος για την πρωτεΐνη FISA, χωρίς όμως την ανίχνευση περαιτέρω ζωνών.