Μελέτη της επαγωγής του "επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα 1-HIF-1" σε λεία μυικά κύτταρα τραχείας υπό συνθήκες in vitro διαφοροποίησης

Abstract

Τα λεία μυϊκά κύτταρα των αεραγωγών, όταν βρίσκονται σε πρωτογενείς καλλιέργειες παρουσία ορού εμβρύου βοός, εμφανίζουν έναν μη διαφοροποιημένο «συνθετικό» φαινότυπο. Έχει δειχθεί ότι αν αφαιρεθεί ο ορός από το θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας, τα λεία μυϊκά κύτταρα ανακτούν τον διαφοροποιημένο «συσταλτό» φαινότυπο. Στην εργασία αυτή, μελετήθηκαν οι μηχανισμοί επαγωγής της υπομονάδας α του «επαγόμενου από την υποξία μεταγραφικού παράγοντα 1» - HIF- 1α σε λεία μυϊκά κύτταρα τραχείας κουνελιού υπό συνθήκες in vitro διαφοροποίησης. Ο «επαγόμενος από την υποξία μεταγραφικός παράγοντας 1» (HIF-1) είναι ο κύριος ρυθμιστής της κυτταρικής υποξίας. Αποτελείται από δύο υπομονάδες: την α και τη β. Η υπομονάδα β εκφράζεται συνεχώς ενώ η υπομονάδα α υπόκειται σε ρύθμιση. Έχει δειχθεί, πρόσφατα, ότι το κοβάλτιο επάγει την έκφραση του HIF-la σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων παρουσία ορού, μέσω της αύξησης της σύνθεσης της πρωτεΐνης που μεσολαβείται από το μονοπάτι της κινάσης της 3- φωσφατιδυλ-ινοσιτόλης και της παραγωγής ενεργών ριζών οξυγόνου. Κατά τη διεξαγωγή της εργασίας αυτής, λεία μυϊκά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό, προκειμένου να ξεκινήσει η διαδικασία διαφοροποίησής τους. Κάτω από τις συνθήκες αυτές, ο ορός επάγει την έκφραση του HIF-la. Ο σκοπός μας ήταν να διερευνήσουμε την επίδραση του χρόνου καλλιέργειας σε θρεπτικό μέσο απουσία ορού, και συνεπώς της διαφοροποίησης, σε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων τραχείας στην επαγωγή του HIF-la καθώς και την κινητική της επαγωγής αυτής. Επιπλέον, ελέγξαμε την επίδραση της προσθήκης ορού σε διαφορετικές συγκεντρώσεις στο μέσο καλλιέργειας στην επαγωγή του HIFla. Ως επαγωγείς του HIF-la χρησιμοποιήσαμε C0CI2, ορό ή συνδυασμό τους. Για το λόγο αυτό, δημιουργήσαμε πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων από τραχεία κουνελιού, τα οποία ταυτοποιήθηκαν με έμμεσο ανοσοφθορισμό και χρήση μονοκλωνικού αντισώματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του HIF-la επάγεται από την πρώτη ημέρα αφαίρεσης του ορού από το θρεπτικό μέσο. Σε διάστημα τριών ημερών αφαίρεσης του ορού, ο HIF-la επάγεται 2 ώρες μετά την προσθήκη των επαγωγέων και βρίσκεται σε υψηλά επίπεδα για διάστημα 6 ωρών. Τέλος, ο ορός σε συγκέντρωση 1% ή υψηλότερη στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας επάγει την έκφραση του HIF-la, φαίνεται όμως ότι οι μεγάλες συγκεντρώσεις, πιθανόν, να δρουν ανασταλτικά στην επαγωγή αυτή.