In vitro και in silico προσέγγιση της οδού περίσωσης των πουρινών

Abstract

Μια σημαντική βιοχημική οδός σχηματισμού πουρινικών μονοφωσφορικών νουκλεοτιδίων πέραν της de novo σύνθεσης τους είναι η οδός περίσωσης των πουρινών. Σε αυτό το βιοχημικό μονοπάτι πραγματοποιείται ανακύκλωση των ελεύθερων πουρινικών βάσεων που προκύπτουν από τον καταβολισμό των νουκλεϊκών οξέων. Η αντίδραση που συμβαίνει κατά την περίσωση των πουρινών είναι η μεταφορά μιας φωσφορικής ριβόζης από το 5- φωσφοριβόζυλο-1-πυροφωσφορικό (PRPP) στην ελεύθερη πουρίνη για το σχηματισμό μονοφωσφορικού νουκλεοτιδίου. Τα ένζυμα που καταλύουν την αντίδραση αυτή είναι οι φωσφοριβοζυλομεταφοράσες των πουρινών (ΡΚΤάσες). Σε αυτή την εργασία ασχοληθήκαμε σε ένα πρώτο μέρος με την απομόνωση δυο ενζύμων που συμμετέχουν στην οδό περίσωσης των πουρινών, την συνθετάση του PRPP και την PRTάση της ξανθίνης και γουανίνης καθώς και ενός βοηθητικού ενζύμου, της ανόργανης πυροφωσφατάσης. Ο στόχος ήταν η εισαγωγή τροποποιημένων γονιδίων σε πλασμίδια-φορείς, και ακολούθως η συγκαθήλωσή των παραγόμενων ενζύμων μέσω των πρόσθετων ολιγοπεπτιδίων ιστιδίνης σε μια στήλη Νικελίου. Το σχήμα αυτό επιτρέπει την κατασκευή ενός μοντέλου βιοαντιδραστήρα παρασκευής νουκλεοτιδίων που παρέχει μια ευκολία στη μεταχείριση παραμέτρων όπως η σχετική συγκέντρωση ενζύμων. Σε ένα δεύτερο μέρος έγινε μια in silico προσέγγιση της μελέτης της συμπεριφοράς του βιοαντιδραστήρα. Για το λόγο αυτό έγινε χρήση του λογισμικού COPASI, με το οποίο εξετάστηκαν μια σειρά παραμέτρων της λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα.