Έκφραση του ανθρώπινου επαγόμενου από την υποξία παράγοντα 1 (HIF-1) σε κύτταρα Saccharomyces cerevisiae : εφαρμογή μιας απλής in vivo μεθόδου για την ανάλυση του HIF-1

Abstract

Ο επαγόμένος από την υποξία παράγοντας HIF-1 παράγεται σε υψηλά επίπεδα όταν τα κύτταρα βρίσκονται κάτω από συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης οξυγόνου και ενεργοποιεί την μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με την ερυθροποίηση, την αγγειογένεση, το μεταβολισμό και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Ο HIF-1 αυξάνει κατά την ογκογένεση παίζοντας σημαντικό ρόλο σε αυτήν και γι αυτό αποτελεί ένα πιθανό στόχο αντικαρκινικής θεραπείας. Τέλος, ο HIF-1 ρυθμίζεται από διάφορα κυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια κάτι που κάνει τη μελέτη της έκφρασής του σε κύτταρα θηλαστικών αρκετά δύσκολη. Για το λόγο αυτό, επιχειρήθηκε η εφαρμογή ενός απλού in vivo συστήματος για τη μελέτη του μηχανισμού δράσης του HIF-1. Συγκεκριμένα, στην παρούσα εργασία έγινε έκφραση του HIF-1 στον σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae, από τον οποίο φυσιολογικά απουσιάζει, με χρήση πλασμιδίων που περιείχαν τα cDNA των υπομονάδων του HIF-1. Ο έλεγχος της έκφρασης του HIF-1 έγινε με SDS-PAGE και ανοσοαποτύπωση. Ο έλεγχος της λειτουργικότητας έγινε με τη δοκιμασία β-γαλακτοσιδάσης η έκφραση της οποίας ελέγχεται από αλληλουχίες απόκρισης σε υποξία (HRE)s. Επιπλέον έγινε προσπάθεια κλωνοποίησης πλασμιδίων με τμήματα της αλληλουχίας του γονιδίου του ανθρώπινου HIF-la, αφού πρώτα είχαν ενισχυθεί με PCR, με σκοπό την ανάλυσή τους με το σύστημα που περιγράφηκε παραπάνω.