Ανίχνευση και μελέτη των αλληλεπιδράσεων in vivo μιας ισομορφής της ανθρώπινης κινάσης SRPK1 με την τεχνική των δυο υβριδίων στον Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Στην παρούσα διατριβή ανιχνεύθηκαν οι μοριακές αλληλεπιδράσεις του Ν- τελικού άκρου της SRPKla (SRPKlaNt), μιας πρόσφατα ανιχνευθείσας μορφής SR κινάσης που προέρχεται από εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου της SRPK1 (του κυριότερου εκπροσώπου των SR κινασών στον άνθρωπο). Οι SR κινάσες φωσφορυλιώνουν σερίνες που βρίσκονται σε μοτίβα RS (εναλλαγές σερίνης/αργινίνης) και ενώ έχουν ανιχνευθεί ως κύριοι ρυθμιστές του ματίσματος μέσω φωσφορυλίωσης των SR παραγόντων ματίσματος, πολλά στοιχεία υποδεικνύουν ότι εμπλέκονται και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες για τις οποίες όμως ο ρόλος τους είναι ασαφής. Σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν να προσεγγισθεί ο ιδιαίτερος ρόλος της SRPKla και μέσω αυτού ο ρόλος των SR κινασών γενικότερα. Για να απομονωθούν οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την αμινοτελική περιοχή της SRPKla χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των δύο υβριδίων στον Saccharomyces cerevisiae. Επιλέχθηκε ως «δόλωμα» και κλωνοποιήθηκε το τμήμα των 528 νουκλεοτιδίων που κωδικοποιεί για τα 176 αμινοξέα της αμινοτελικής περιοχής της SRPKla (SRPKlaNt) και το οποίο την διαφοροποιεί από την SRPK1. Αφού επιβεβαιώθηκε ότι το «δόλωμα» δεν ενεργοποιεί τα γονίδια αναφοράς εφαρμόστηκε η μέθοδος των δύο υβριδίων με τη χρήση cDNA βιβλιοθήκης η οποία αντιπροσώπευε τα mRNA που εκφράζονται σε αγέννητο έμβρυο ποντικού 9,5 και 10,5 ημερών. Ακολούθησε η επιλογή και κατάταξη των επιλεχθέντων κλώνων βάσει της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς HIS3. Διασώθηκαν τα 86 πλασμιδιακά DNA από τα 235 επιλεγμένα στελέχη S.c. τα οποία ελέγχθηκαν για την επαλήθευση του αρχικού φαινοτύπου, δηλ. ότι: ΐ) τα πλασμιδιακά DNA περιέχουν ένθεμα της cDNA βιβλιοθήκης. Η) δεν ενεργοποιούν από μόνα τους την έκφραση των γονιδίων αναφοράς και τρίτον iii) ότι επιβεβαιώνουν τον φαινότυπο με τον οποίο επιλέχθηκαν εφ’ όσον επανεισαχθούν στο αρχικό στέλεχος. Για τις 67 «λείες» που επιλέχθηκαν τελικά διερευνήθηκε εάν είναι ικανές να ενεργοποιήσουν τα γονίδια αναφοράς παρουσία του πλασμιδίου-δολώματος που περιείχε το cDNA της SRPK1 (του τμήματος εκείνου που είναι κοινό μεταξύ SRPK1 και SRPKla). Αφού διαπιστώθηκε ότι οι αλληλεπιδράσεις του Ν-τελικού τμήματος της SRPKla είναι εξειδικευμένες έγινε περαιτέρω ανάλυση τους. Αρχικά αναλύθηκαν και ταυτοποιήθηκαν οι αλληλουχίες. Κατόπιν κατηγοριοποιήθηκαν και αξιολογήθηκαν με βάση τα γνωστά από τη βιβλιογραφία δεδομένα για την κάθε μία αλλά και για τις SR κινάσες. Για τις λείες που δεν ταυτίστηκαν με γνωστές αλληλουχίες στις βάσεις δεδομένων έγινε ανάλυση των αντίστοιχων mRNAs σε ανθρώπινους ιστούς με την μέθοδο υβριδισμού κατά Northern. Για δέκα από αυτές έγινε υποκλωνοποίηση σε κατάλληλα πλασμίδια ώστε να παραχθούν πρωτεΐνες σύντηξης με GST και να βεβαιωθεί ότι αλληλεπιδρούν in vitro με το Ν-τελικό άκρο της SRPKla με χρωματογραφία αγχιστείας. Τέλος, επιλέχθηκε μία «λεία», ο παράγοντας SAFB (πρωτεΐνη της πυρηνικής μήτρας) για να μελετηθεί πιο διεξοδικά η σχέση του με την SRPKla. Η επακόλουθη επιβεβαίωση της δημιουργίας συμπλόκου του SAFB με την SRPKla in vitro και in vivo σε κύτταρα θηλαστικών α) αναδεικνύει την αξία του συστήματος των δύο υβριδίων ως αξιόλογη μέθοδο ανίχνευσης μοριακών αλληλεπιδράσεων της SRPKla και β) υποδηλώνει σχέση των SR κινασών με βασικούς κυτταρικούς μηχανισμούς εκτός, αποκλειστικά του ματίσματος, όπως η διαμόρφωση της χρωματίνης και η μεταγραφή, στην οποία εμπλέκεται ο SAFB αλλά και πολλές άλλες από τις υποψήφιες αλληλεπιδρούσες με την SRPKla πρωτεΐνη.