Σύγκριση επιπέδων τελομεράσης σε ασθενείς με χρόνιες λοιμώξεις από τους ιούς ηπατίτιδας B και C

Abstract

Τα τελομερή αποτελούν τα φυσικά άκρα των γραμμικών χρωμοσωμάτων στα οποία παρουσιάζεται το λεγόμενο «πρόβλημα ολοκλήρωσης της αντιγραφής». Αποτέλεσμα του συγκεκριμένου προβλήματος είναι, σε κάθε διαίρεση, τα χρωμοσώματα να χάνουν περίπου 20-200 ζεύγη βάσεων από τα τελομερή τους. Η τελομεράση είναι μία RNA-εξαρτώμενη DNA πολυμεράση, η οποία διατηρεί το μήκος των τελομερών παρέχοντας στα κύτταρα τη δυνατότητα για απεριόριστο αριθμό διαιρέσεων. Αποτελείται από δύο υπομονάδες, την RNA (hTR) και την καταλυτική υπομονάδα (hTERT), η οποία έχει δράση αντίστροφης μεταγραφάσης, ενώ υπάρχουν και πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την τελομεράση συμβάλλοντας στη δημιουργία ενός ενεργού ολοενζύμου. Η δραστικότητα της τελομεράσης καταστέλλεται κατά την εμβρυϊκή διαφοροποίηση στα περισσότερα σωματικά κύτταρα. Ωστόσο, παρατηρείται έκφραση σε ορισμένους τύπους κυττάρων, όπως για παράδειγμα σε αιμοποιητικά αρχέγονα κύτταρα, σε αναπαραγωγικά κύτταρα, σε ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα, σε κύτταρα του μυελού των οστών κ.ά. Επιπλέον, έχει βρεθεί έκφραση του ενζύμου σε 85-90% των περιπτώσεων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (ΗΚΚ). Η μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου hTERT, από την οποία εξαρτάται η δράση της τελομεράσης, και στην οποία κατέχει κεντρικό ρόλο η ρυθμιστική περιοχή του υποκινητή, πραγματοποιείται τόσο μέσω μεταγραφικών παραγόντων όσο και μέσω επιγενετικών μηχανισμών. Μεταξύ των επιγενετικών μηχανισμών που ελέγχουν την έκφραση του γονιδίου hTERT κυριαρχεί η μεθυλίωση του DNA, λόγω της παρουσίας μεγάλου αριθμού νησίδων CpG εντός του υποκινητή. Ο τρόπος με τον οποίο η μεθυλίωση επηρεάζει την έκφραση του hTERT αποτελεί αντικείμενο έρευνας των τελευταίων ετών και δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί ακόμη. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) αποτελεί έναν από τους πιο συνήθεις κακοήθεις όγκους παγκοσμίως. Ο κυριότερος παράγοντας πρόκλησης του ΗΚΚ είναι οι χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες και έχει βρεθεί ότι το 70-90% των ατόμων που θα αναπτύξουν κίρρωση θα αναπτύξουν τελικά και ΗΚΚ. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η χρόνια ηπατίτιδα Β και C προσφέρει τόσο το μιτογόνο όσο και το μεταλλαξογόνο περιβάλλον το οποίο είναι σε θέση να προκαλέσει την τροποποίηση του γενετικού υλικού των ηπατοκυττάρων. Μεταξύ των μηχανισμών που ενέχονται στην τροποποίηση του γενετικού υλικού των ηπατοκυττάρων συγκαταλέγονται η ενεργοποίηση καθώς και η απενεργοποίηση διάφορων γονιδίων. Το γονίδιο hTERT συγκαταλέγεται μεταξύ των γονιδίων τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή του «μοριακού προφίλ» των ασθενών με χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες. Με βάση τα παραπάνω, το πεδίο έρευνας της συγκεκριμένης διατριβής αποτελεί η συσχέτιση της έκφρασης της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης σε ιστούς με χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες τόσο με την αντίστοιχη σε υγιείς και καρκινικούς ιστούς όσο και με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους, καθώς και η διερεύνηση του μηχανισμού ρύθμισης της έκφρασης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν 3 ομάδες ασθενών: άτομα που δεν εμφάνιζαν καμία ηπατοπάθεια και αποτελούσαν την ομάδα ελέγχου, άτομα με χρόνια ιογενή ηπατίτιδα και άτομα με ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Από τα άτομα αυτά απομονώθηκε DNA και RNA τόσο από περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα όσο και από ιστούς ήπατος. Με το ημιποσοτικό πρωτόκολλο πολλαπλασιασμού των τελομερικών επαναλήψεων υπολογίστηκε η δραστικότητα της τελομεράσης, ενώ με την χρήση ποσοτικής PCR εντοπίστηκαν τα επίπεδα του hTERT mRNA. Επιπλέον, με την χρήση ποσοτικής PCR αλλά και με την εύρεση της αλληλουχίας των βάσεων διερευνήθηκε αν και με ποιον τρόπο ο επιγενετικός μηχανισμός της μεθυλίωσης ρυθμίζει την έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης στα ηπατοκύτταρα. Όσον αφορά στην ποσοτικοποίηση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης (hTERT) στα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα, διαπιστώθηκε σημαντική μείωση στα επίπεδα των hTERT mRNA μεταγράφων στα συγκεκριμένα κύτταρα των ασθενών με χρόνια HBV και HCV λοίμωξη σε σχέση με τους υγιείς, ενώ τα επίπεδα της hTERT ήταν ανεξάρτητα από την κλινική κατάσταση των ασθενών, την ηλικία, το φύλο, τη διάρκεια της νόσου και τα επίπεδα των αμινοτρανσφερασών. Τα μειωμένα επίπεδα της έκφρασης του hTERT mRNA αποτελούν σημείο πρώιμης γήρανσης του ανοσοποιητικού συστήματος και προτείνεται ότι η hTERT συμμετέχει στην ανοσολογική δυσλειτουργία των ασθενών με χρόνια HBV και HCV λοίμωξη. Τα ευρήματα που προέκυψαν από την μέτρηση της δραστικότητας της τελομεράσης και την ποσοτικοποίηση της έκφρασης της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης φανέρωσαν ότι όλα τα υγιή ηπατοκύτταρα δεν παρουσιάζουν έκφραση τελομεράσης και hTERT mRNA, σε αντίθεση με όλα τα κύτταρα που προέρχονται από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα τα οποία εμφανίζουν μέγιστες τιμές έκφρασης τελομεράσης και hTERT mRNA. Στις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες, οι οποίες είναι μη καρκινικές καταστάσεις, δεν θα αναμενόταν έκφραση τελομεράσης. Παρόλα αυτά, είναι σημαντικό ότι το 15.6% των ιστών με χρόνια ιογενή ηπατίτιδα βρέθηκε να παρουσιάζει χαμηλή αλλά σημαντική δραστικότητα τελομεράσης καθώς και έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας hTERT. Η υπερέκφραση του hTERT mRNA και η αυξημένη δραστικότητα της τελομεράσης στο ήπαρ των ατόμων που πάσχουν από ΗΚΚ επιτρέπει στο ηπατοκύτταρο ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και καταλήγει να είναι ένας από τους παράγοντες που οδηγούν στην ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Επιπρόσθετα, στους ασθενείς με χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες τα επίπεδα του hTERT mRNA βρέθηκαν υψηλότερα στα άτομα που εμφάνισαν μεγαλύτερη διάρκεια της νόσου. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό και με τα παραπάνω συμπεράσματα επιβάλλει την προσεκτικότερη παρακολούθηση της πορείας της νόσου στα άτομα που εμφανίζουν χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια και ταυτόχρονα παρουσιάζουν έκφραση τελομεράσης και hTERT mRNA σε βιοψίες ήπατος, θεωρώντας ότι αυτή η υποκατηγορία ασθενών ίσως να έχει μεγαλύτερη πιθανότητα ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Η διερεύνηση του μηχανισμού που ελέγχει την έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας, επικεντρώθηκε στην επιγενετική ρύθμιση της hTERT μέσω της μεθυλίωσης του DNA. Τα αποτελέσματα της διατριβής φανέρωσαν ότι η πλήρης μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου hTERT στα κύτταρα του ήπατος, εμποδίζει την σύνδεση μεταγραφικών παραγόντων και αναστέλλει την έκφρασή του, γεγονός που παρατηρείται σε υγιείς ιστούς και σε ένα ποσοστό ιστών με χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια. Αντιθέτως, σε ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών με χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια και σε όλους τους ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα εμφανίζεται μη μεθυλιωμένος ή με μικρά ποσοστά μεθυλίωσης ο υποκινητής του γονιδίου hTERT. Για πρώτη φορά αποδείχθηκε ότι το ποσοστό της μεθυλίωσης σχετίζεται με την έκφραση του γονιδίου hTERT στα ηπατοκύτταρα, αλλά και ότι τα επίπεδα μεθυλίωσης αποτελούν δείκτη επιβίωσης στα άτομα με ΗΚΚ. Για την χρήση του ποσοστού μεθυλίωσης στον υποκινητή του γονιδίου hTERT ως προγνωστικό δείκτη και σε άτομα με χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια επιβάλλεται επιβάλλεται η μεγαλύτερη διάρκεια παρακολούθησης των ασθενών (follow up) που παρουσίασαν χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης και επομένως σημαντική έκφραση της τελομεράσης.