Μελέτη των μοριακών μηχανισμών απόκρισης στην υποξία : ανίχνευση και ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον HIF-1a με το σύστημα των δύο υβριδίων

Abstract

Όταν ένα κύτταρο βρεθεί σε κατάσταση υποξίας (μειωμένη συγκέντρωση οξυγόνου) αντιδρά ενεργοποιώντας την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων, τα προϊόντα των οποίων είναι απαραίτητα για την επιβίωσή του σε συνθήκες έλλειψης οξυγόνου. Ο μεταγραφικός παράγοντας HIF-1 είναι ο κομβικός παράγοντας ρύθμισης της κυτταρική απόκρισης στην υποξία. Αποτελείται από δύο υπομονάδες (α και β) εκ των οποίων μόνο η μία (HIF-la) ρυθμίζεται από την ενδοκυττάρια συγκέντρωση του οξυγόνου. Επομένως, ο HIF-la αλληλεπιδρά με πληθώρα μορίων και η λειτουργία του επηρεάζει πολλές καταστάσεις όπου η υποξία παίζει σημαντικό ρόλο, όπως είναι τα καρδιαγγειακά προβλήματα κι ο καρκίνος. Στην παρούσα πειραματική εργασία, εφαρμόσαμε το σύστημα των δύο υβριδίων για να ανιχνεύσουμε αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης του HIF-la με άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες είναι δυνατό να επηρεάζουν την ενεργοποίησή του ή τον τρόπο δράσης του. Αρχικά, κλωνοποιήσαμε μια επιλεγμένη υποπεριοχή του γονιδίου του HIF-la στον πλασμιδιακό φορέα pGBT9, σε σύντηξη με την περιοχή δέσμευσης (BD-binding domain) του μεταγραφικού παράγοντα GAL4 (πλασμίδιο «δόλωμα»). Το στέλεχος του Saccharomyces cerevisiae PJ694A, που φέρει τα γονίδια αναφοράς HIS3, ADE2, LacZ, κάτω από τον έλεγχο του μεταγραφικού παράγοντα GAL4, μετασχηματίστηκε με το πλασμίδιο «δόλωμα». Στη συνέχεια, κάθε ένα από τα μετασχηματισμένα στελέχη, μετασχηματίστηκε επιπλέον με μία βιβλιοθήκη cDNA από έμβρυο ποντικού. Το ετερογενές σύνολο των cDNA της βιβλιοθήκης περιέχεται στον πλασμιδιακό φορέα pVP16, σε σύντηξη με την περιοχή ενεργοποίησης (ADactivation domain) του μεταγραφικού παράγοντα VP16 (πλασμίδιο «λεία»). Με την εφαρμογή του συστήματος των δύο υβριδίων, διερευνήσαμε 16x106 , πιθανές αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης «δόλωμα» (GAL4BD-HIF-la) με τις πρωτεΐνες «λεία» (VΡ16AD-άγνωστη πρωτεΐνη), κι από αυτές επιλέχθηκαν 500 για περαιτέρω μελέτη και ταυτοποίηση. Έγινε ταυτοποίηση σε δύο από αυτές και μόνο για την μία, βρήκαμε ότι εμφανίζει ομολογία με το δυνητικό cDNA μιας πρωτεΐνης στον άνθρωπο, της ΚΙΑΑ0632.